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1、免疫固定电泳操作规程一．项目名称免疫固定电泳(ＨYDRAGELＩＭMＵNOＦＩXATＩＯN)二．检验方法名称琼脂糖凝胶免疫固定电泳三．方法学原理血清蛋白电泳中出现得异常条带主要存在于β-球蛋白与γ-球蛋白区域,通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带,可运用免疫固定技术。免疫固定电泳就是一种简单得技术,电泳后得蛋白质与相应抗体形成复合物与被固定在相应得位置上,通过下列四个步骤:１。蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。2.电泳后已分离得蛋白质被固定并产生免疫沉淀:应用固定剂与抗血清加于凝胶表面得泳道上,并让固定剂与抗血清在凝
2、胶内渗透扩散。3.使用吸水纸与清洗将未沉淀得蛋白质去除,已被沉淀得蛋白质贮留在凝胶内。4、将蛋白质染色,并将这些免疫沉淀区带得位置与蛋白质经电泳后观察到得异常蛋白区带进行比较。为了精确识别单克隆区带,样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后,ＥLP作为参考泳道以显示电泳后得蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它(们)与抗血清,γ(IｇＧ)、α(IgＡ)、μ(IgM)重链与κ、λ轻链(游离与非游离)反应与否进行鉴别。该技术简单、快速、图象清晰,易于解释结果、四．方法学溯源自１930年由Ｔiseｌius发现了移界电泳(moｖingbｏ
3、undaｒyeｅｃtrｏpｈoresis),而后,这种技术得各种局限性已逐渐被区带电泳(zoｎeｅlecｒrｏｐhoresis)所克服,区带电泳得条件与支持介质得选择就是电泳成败得关键、通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性就是鉴定某一蛋白成分最好得方法,免疫固定电泳技术就是目前应用最广泛得方法之一。五．仪器（一）型号:SEＢIAＨYDＲASYＳ(ＰN1210)（二）分析与计算参数:1．处理量:约18个样本/小时2．所需样本量:１０ul3．检验时间:约55分钟4．重复性:有良好得批内与批间重复性5．电泳参数:电压0-30０V(可选至3
4、0０0V)电流0－500mＡ功率０－１00W六．试剂及配套品（一）试剂1．HYDＲＡGＥL1IF试剂盒ＨYＤＲAGEＬ２IF试剂盒HYDRAGEL4IF试剂盒HYDRAＧEL9IF试剂盒（1）商标:SEBIA（2）包装规格:1０测试／20测试/40测试/90测试（3）货号:PN43０1/PＮ43０2/PN４３0４/PN43０92．脱色液(1)商标:SEBIA(2)包装规格:Paｃｋfｏr10×10０ｍl(3)货号:PＮ454０(4)成分:柠檬酸3。洗涤液（1）商标:SEBＩA（2）包装规格:Paｃkfor10×80ｍｌ（3）货号:PN4
5、541（4）成分:叠氮钠4、稀释剂（1）商标:SＥBＩA（2）包装规格:Pａckfoｒ1×5ml（3）货号:PN4５87（二）配套品:ＩＦ试剂抗体(1)商标:SEBIA(2)包装规格:Packfoｒ5×1ml(3)PN４3１５七．操作步骤㈠开机,启动电泳仪、㈡将1只(用于1,２IF),2只(用于4ＩF)或3只(用于9IＦ)点样梳置于整表面,有数字得一端向上,在2分钟内完成每块加样梳得加样,每孔加1０uｌ样品,然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。电泳/免疫固定泳道孔号ＥLPGAＭKLＨydraｓyｓ１IF12３４５6Hyｄrａsys2/
6、4ＩF1或3号样本２3４5672或4号样本91０11121314Hydrasｙs9IF１,4或7号样本1234562,5或8号样本7891011123,6或9号样本8㈢选择相应得“IF"电泳程序,㈣从包装袋内取出缓冲条,将其固定在电极支架背侧得钉上,再取出凝胶,用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余得液体,在温控板表面下1/3处加20０ｕl蒸馏水或去离子水,将凝胶片底边紧靠框架底边,边缘对齐边线,略弯曲凝胶片慢慢放平,注意凝胶片下面勿出现气泡、㈤自然放下支架,从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下得保护支架,1、２ＩF得点样梳置于支架6号位,4IＦ
7、得２只点样梳则分别置于3号与9号,9IＦ得3只点样梳则分别置于2,６号与１0号,注意点样梳上得数字必须面对操作者,关上电泳舱盖,按下键盘左侧得绿色箭头“ＳTARＴ"键,电泳开始,确保仪器右侧得空气通道不被堵塞、㈥电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束,进行免疫固定操作。打开电泳盖,将加样梳与缓冲条丢弃,移走两支架,用湿纸巾擦拭电极丝,将抗体加样条装入抗体加样架上,按如下要求将动物血清抗体加入抗体加样条:··Hydrａsys1IF用6孔抗体加样条:每孔加８μl抗体··Hydraｓｙs2/4IF用１5孔抗体加样条:2人份每孔加8μl抗体,4人份
8、每孔加1２μl抗体··Hｙｄｒaｓys9IF用18孔抗体加样条:每孔加8μｌ抗体固定好抗体加样架,将抗体加到凝胶片上。然后关上电泳舱盖,按“Ｓtａrt”键开始免疫固定。㈦10分钟后,电泳仪自动发出蜂鸣声,提
