Solexa-SmallRNA-样品制备标准操作规程.doc

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1、SolexaSmallRNA样品制备第3版SolexaSmallRNA样品制备标准操作规程（第3版）SmallRNA样品制备组摘要：SolexaSmallRNA样品制备主要包括以下几个内容：1）将总RNA跑TBU变性胶，回收16－30nt的SmallRNA；2）5'adaptor连接并纯化回收连接产物；3）3'adaptor连接并纯化回收连接产物；4）RT－PCR并回收～92bp大小的条带。整个流程需要约4天时间。1试剂及耗材1.1试剂1.1.1购买试剂及耗材名称厂家货号存储条件SuperScript™IIReverseTranscriptionKit(10,000Units)Invi

2、trogen18064-014-20℃RNaseOUT™(5000U)Invitrogen10777-019-20℃14-30ssRNATakaraD3416-80℃25bpDNAladder(50µg)Invitrogen10597-011-20℃10bpDNAladder(50µg)Invitrogen10821-015-20℃Novex®15%TBE-UreaGel,1.0mm/10wellInvitrogenEC6885BOX4℃Novex®10%TBE-UreaGel,1.0mm/10wellInvitrogenEC6875BOX4℃6%Novex®TBEPAGEGel,1.

3、0mm,10wellInvitrogenEC6265BOX4℃NEBuffer2stock(10x)NEBB7002S-20℃DEPC-H2OAmbionAM9915G4℃/RTTEpH8.0Buffer(500ml)AmbionAM98494℃/RTPelletPaint®NFCo-precipitantNovagen70748-4-20℃Spin-XCelluloseAcetateFilter(2ml,0.45µm)Fisher07-200-388RT10mMdNTPmixNEBN0447L-20℃DEPCCalbiochem2987114℃T4RNALigase1NEBM0204

4、S-20℃T4RNALigase(500U,10U/ul)PromegaM1051-20℃18SolexaSmallRNA样品制备第3版T4RNALigase(200U，30U/ul)TakaraD2050-20℃2xGelLoadingBufferIIAmbionAM8546G-20℃5MNaCl(100mL)AmbionAM9760G4℃/RTGlycogen(5x1mL)AmbionAM9510-20℃/-80℃2xPhusionHFmastermixFinnzymesF-531S-20℃/-80℃5’RNAadaptor(25µM)Takara合成-80℃3’RNAadapto

5、r(25µM)Takara合成-80℃SmallRNART-primer( 100µM)Takara合成-20℃SmallRNAP5longprimer(100µM)Takara合成-20℃SmallRNAP7primer(100µM)Takara合成-20℃无水乙醇国产RT1000ulSterile,RNAase-freepipettetipsAxygenRT200ulSterile,RNAase-freepipettetipsAxygenRT10ulSterile,RNAase-freepipettetipsAxygenRT2mlSterile,RNAase-freemicrotu

6、besAxygenMCT-200-CRT1.5mlSterile,RNAase-freemicrotubesAxygenMCT-150-CRT0.2mlSterile,PCRmicrotubesAxygenPCR-02D-CRT0.5mlnon-stickSterile,RNAase-freemicrotubesAmbionAM12340RTVWR加样枪头VWR?RTRNAzapAmbionAM9890RTPureEtBr(10mg/ml)Invitrogen15585-011RT30%H2O2国产RTAgilentRNA6000NanokitAgilent5067-1511RNAla

7、dder－80℃保存试剂在4℃保存芯片在RT。AgilentDNA1000kitAgilent5067-1504试剂在4℃芯片在RT1.1.2配置试剂及耗材(1)DEPC－treatedwater：1000ml去离子水中加入100ul－1000ulDEPC，37℃放置过夜（至少2小时）或室温下过夜，121℃高压灭菌30分钟，主要用于缓冲液配制。(2)1xTBE：1000mlDEPC－treatedwater中加入10.8gTris－base，5