肺炎克雷伯菌-ESBL.doc

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1、肺炎克雷伯菌是医院感染常见的条件致病菌。临床肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素及单环β-内酰胺类抗生素敏感性降低，主要原因是产超广谱β-内酰胺酶。A类超广谱β-内酰胺酶(Extend-Spectrumβ-Lactamases,ESBLs)在克雷伯菌、大肠杆菌为代表的肠杆菌科细胞中最为多见，包括TEM型、SHV型、non-TEM、non-SHV型三类，CTX-M-ESBLs是non-TEM、non-SHV型的重要代表。本文对多重耐药的肺炎克雷伯菌临床株KP9941产超广谱β-内酰胺酶的耐药机制进行研究。材料

2、与方法一、材料(一)菌株1.测试菌株KP9941是1999年自我院一患者痰标本中分离获得。菌株鉴定采用AP120E(BioMerieux,MarcyL‘Etoile,France)系统。2.参考菌株ATCC25922，本实验室保存。E.coliJ53-2(SHV-1),Wu,S.W.博士惠赠，E.coliJ53-2(TEM-4),沈定霞教授惠赠，E.coliJ53-2(SHV-3),，王睿教授惠赠。(二)药敏纸片奥格门丁(阿莫西林+克拉维酸，AMC，20μg/10μg)，头孢他定(CAZ，

3、30μg)，头孢噻肟(CTX，30μg)，头孢曲松(CRO，30μg)，亚胺培南(IPM，10μg)等为Oxoid公司产品。氨曲南(ATM，30μg)，Bristol-MyersSquibb公司产品。环丙沙星(CIP，5μg)，庆大霉素(Gm,10μg)纸片购自北京药物生物制品检定所。(三)工具酶与DNA分子量参照物PCR缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶购自Takara生物工程公司。限制内切酶NheI(G‘CTAGC)购自美国MBI公司。DNA分子量参照物DL-2000购自Takara生物工

4、程公司。(四)PCR纯化试剂盒：WizardPCRPrepsDNAPurificationSystem(Promega)二、方法(一)琼脂纸片扩散法(Kirby-Bauer,K-B法)药物敏感试验应用K-B法测定临床菌株KP9941对抗菌药物的敏感性，药敏实验培养基为Mueller-Hinton琼脂培养基(M-H，OXOID公司)。药敏判定标准遵照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)规定执行。(二)双纸片协同试验(DDST)挑取单个新鲜菌落，置于灭菌生理盐水中混匀，用麦氏比浊管比浊

5、至0.5×108，无菌棉签将待测菌液均匀涂布在厚度约为4mm的M-H琼脂上。在平皿中央放置AMC纸片，四周放置四种三代头孢菌素纸片，三代头孢菌素纸片与AMC纸片中心距离约为25mm。温箱35℃孵育16～18小时后读取结果。如果三代头孢菌素纸片邻近AMC纸片侧的抑菌环增大(≥5mm)，视为产ESBLs阳性菌株。(三)细菌总DNA提取参照PitoutJDD方法提取细菌总DNA。取2μl提取物作为PCR模板。(四)PCR扩增根据GenBank和EMBL公布的blaTEMDNA、blaSHVDNA和b

6、laCTX-M-DNA序列分别设计合成3对特异性引物TP1，TP2；SP1，SP2；M1，M2(上海生工生物工程有限公司合成)，分别扩增349bp、1014bp、551bp长的片段。TP1：5‘CAGCGAATTCAGTTCTGCTATGTGG3‘，TP2：5‘ATTGCTGCAGGCATCGTGGT3‘。SP1：5‘CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC3‘，SP2：5‘TCTTTCCGATGCCGCCGCCAGTCA3‘。M1：5‘CGCTTTGCGATGTGCAG3‘，M2：5‘ACC

7、GCGATATCGTTGGT3‘。3对引物分别经GeneBankB1AST软件进行同源性分析，与GeneBank核酸数据库中非目的序列无同源性。PCR反应体系(50μl)：10×Taq酶缓冲液5μl，引物各100pmol，4×dNTPs100μmol/L模板NA2μl，Taq酶2.5U。PCR扩增blaTEMDNA即预变性94℃5分钟。变性94℃45秒，复性55℃45秒，延伸72℃60秒，共30循环。最后，72℃延伸5分钟，PCR扩增blaSHVDNA复性55℃，PCR扩增blaCTX-M-ESBL

8、s复性52℃。PCR产物在10%的琼脂糖凝胶上电泳，在波长254nm的紫外灯下检测扩增结果。大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照，E.coliJ53-2(TEM-4)和E.coliJ53-2(SHV-3)的细菌总DNA分别作为blaTEMDNA、blaSHVDNA的阳性对照。(五)PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)PCR产物纯化参照WizardPCRPrepsDNAPurificationSystem使用说明进行。限制内切酶NheI(G