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《水溶性亲和超滤载体的制备和应用_朱家文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、Vo.l25No.6华东理工大学学报1999-12JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology563+水溶性亲和超滤载体的制备和应用*12112朱家文,曹学君,武斌,戴干策,邬行彦(1.华东理工大学化学工程研究所,上海200237;2.华东理工大学生化工程系)摘要:用DextranT2000,经环氧氯丙烷交联并氧化产生部分羧基,偶联对氨基苯甲脒制得水溶性亲和载体巨配基。配基密度为71.4μmol/g。截留分子量为10万的超滤膜对所制亲和载体的截
2、留率大于99.5%,但尿激酶能自由通过。将比活为500IU/A280的尿激酶粗品经亲和超滤得到纯化的尿激酶,比活达66300IU/A280,纯度提高133倍,回收率达83.4%。关键词:亲和超滤;葡聚糖;尿激酶;对氨基苯甲脒;环氧氯丙烷中图分类号:Q503;Q55文献标识码:A文章编号:1006-3080(1999)06-0563-04亲和超滤纯化活性蛋白药物是近年来颇受关注的生物分离新技术,其特点是将亲和吸附与超滤结1材料与方法合起来,兼具两者分离选择性好、提纯倍数高、能大规模连续操作和易于放大等
3、优点。亲和超滤所用空1.1材料[1～3]白载体有两类,一类是水不溶性微载体,另一类N-戊二酰-甘氨酰-精氨酰-7-氨基-4-甲基香豆[4～5]是水溶性大分子载体。利用水溶性载体有许多素(GGA-MCA)和对氨基苯甲脒,美国Sigma公司;优点:亲和载体与目标蛋白在均相体系中反应速度EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐),快,达到吸附或洗脱平衡的时间极短,吸附容量大。德国MERCK公司;DextranT2000(相对分子质量这一点对亲和超滤很有利,可以将目标蛋白溶液与200万),Ph
4、armacia公司;尿激酶标准品,购于中国亲和载体溶液,一边混合,一边进行超滤,而无需另药品生物制品检定所;尿激酶粗制品,购于上海医药[6]备储槽进行反应;洗脱时也一样。另外,水溶性亲工业研究院生化室;环氧氯丙烷为分析纯。和载体的吸附容量较大。1.2仪器葡聚糖是应用较多的水溶性载体,因其为天然F950荧光分光计,上海第三分析仪厂;M750产物,对人体安全,相对分子质量大,易于被膜截留,微量可见紫外分光光度计,上海生化所研制,江苏泰适用于注射用蛋白质药物的分离。文献报道的亲和州无线电仪器厂生产。中空纤
5、维超滤器(截留分子量载体制备方法是将葡聚糖在催化剂存在下用环氧氯为10万),天津纺织工学院生产。平板超滤器(截留丙烷进行活化,产生末端为氯的活性基团,进而与配分子量为5000),美国Milipore公司生产。基偶联。此方法配基偶联反应活性低,反应时间1.3分析方法[7～8][9]长。另一种制备葡聚糖亲和超滤载体的方法对氨基苯甲脒配基密度测定:配基偶联后,超滤1%为葡聚糖在碱性下,以环氧氯丙烷活化,经胺化,再反应液,取超滤液在292nm测紫外吸光度,(E1cm=[8]与琥珀酸酐作用,得到羧基末端,再与
6、配基偶联。以800);DextranT2000浓度测定:用旋光法([T]=[11]该方法制备的载体用于亲和超滤研究取得了较好的+199°);羧基密度测定:0.1mol/LHCl滴定,pH[12]结果,但该法反应步骤多,操作繁琐,收率低。从7.0滴定至3.0;尿激酶活力测定:荧光分光[13]本文提出了一种新的制备葡聚糖亲和超滤载体法,发射波长为380nm,激发波长为460nm;蛋白的简易方法,利用在碱性下加热,当无还原剂存在质浓度测定,在280nm处的紫外吸光度。时,部分葡萄糖分子产生羧基,同时,加环
7、氧氯丙烷1.4亲和载体制备[10]进行交联,然后,在水溶性碳二亚胺存在下直接取2gDextranT2000,0.8g(相当于0.4mol/L与带氨基的配基偶联而得到亲和载体。NaCl)NaOH溶于50mL水中,加环氧氯丙烷2.0mL,于60°C反应2h,超滤除去小分子残留反应物。+国家自然科学基金资助项目(29376235)加入对氨基苯甲脒100mg,EDC150mg,保持pH*E-mail:jzhu@npc.haplink.com.cn收稿日期:1999-01-184.0～4.5,于室温反应12h
8、,超滤除去残留反应物,564华东理工大学学报第25卷得水溶性亲和载体。1.5超滤器对载体与尿激酶的截留实验将200mL含0.5g亲和载体的水溶液以全回流操作进行超滤,滤液和保留液均回流至原液中(操作方式见图1),在同一时间测定保留液和超滤液旋光度,计算载体截留率。图2亲和超滤操作示意图Fig.2Schematicdiagramofaffinityultrafiltration4.0)洗脱,收集洗脱液。用截留分子量为5000的超滤膜浓缩尿激酶,测定酶与蛋白质浓度。2结果
