维生素D3的含量检验方法.doc

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1、维生素D3的含量检验方法一、目的：建立维生素D3含量检验操作规程，保证分析结果的准确性。二、依据：GB/T5413.9-1997三、范围：本规程适用于本公司维生素D3含量检验操作四、职责：质量检验员对本标准的实施负责五、正文：1、试制和溶液1.1高峰氏淀粉酶（Taka-Diastase）1.2异丙醇：色谱纯1.3焦性没食子酸的乙醇溶液15g/L1.4氢氧化钾溶液：质量比100:501.5石油醚：沸程30~601.6甲醇：重蒸后使用。1.7正己烷：色谱纯。1.8环己烷：色谱纯1.9维生素D3标准储备液：含维生素D3100ug/ml（称取10mg维生素D3，用

2、甲醇定容于100ml量瓶中）1.10维生素D3标准工作液：取维生素D3标准储备液1ml于100ml量瓶中，用甲醇定容。2、实验室常用仪器。2.1高效液相色谱仪：具有可变波长的紫外分光检测器、数据处理系统或记录仪。2.2平底烧瓶：250ml2.3分液漏斗：500ml2.4旋转蒸发器。3分析步骤3.1试样处理准确称取10g样品，放入250ml平底烧瓶中，加入1gTaka淀粉酶（3.1），再加入30ml45~50℃的蒸馏水，混合均匀后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞，置45℃烘箱内30min，于上述样品中加入100ml没食子酸的乙醇溶液（3.3），充分混匀后加入5

3、0ml氢氧化钾溶液（3.4），在蒸汽浴上回流30min后，立即冷却到室温。将冷却后的皂化液转入500ml分液漏斗中，用100ml水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中；于分液漏斗中加入100ml石油醚（3.5），盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min，静置分层，将水相放入另一500ml分液漏斗中。重复上述萃取过程二次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干后，用石油醚转移至10ml量瓶中，定容。吸取7ml醚液至一试管中，用氮气将醚液吹干，加入1ml正己烷，即得供试品溶液。3.2

4、测定3.2.1测定液的制备仪器条件色谱柱：30cm×40mm，硅胶柱流动相：环己烷（3.7）与正己烷（3.8）按体积比1:1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇（3.2）流速：1ml/min波长：265nm柱温：20℃灵敏度：0.005AU/MV注射体积：200ul制备：注射50ul维生素D标样和200ul样品溶液（试管B），根据维生素D标样的保留时间收集维生素D与试管C中，将试管C用氮气吹干，准确加入0.2ml甲醇（3.6）溶解。3.2.2测定步骤仪器条件色谱柱：25cm×4.6mm，C18或等同性能的色谱柱流动相：甲醇流速：1ml/min柱温：20℃波

5、长：265nm灵敏度：0.005AU/MV注射体积：50ul注射50ul维生素D标准溶液，注射50ul样品溶液（试管C中），得到标样和样品溶、液中维生素D峰面积或峰高4、计算：Cs×10/75×100×40m×1000样品中维生素D(IU/100g)=ASASdCs=×Csd式中：Cs—进样液中维生素D的质量浓度，ug/mlm—样品的质量，gAS—进样液中维生素D的峰高（或峰面积）ASd—标样中维生素D的峰高（或峰面积）Csd—标样中维生素D的质量浓度，ug/ml计算结果精确到小数点后一位。