免疫组化操作步骤.pdf

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1、精品文档免疫组化操作流程试剂准备1.PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L。2.0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。即抗原修复液3.PBST:PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST4.3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。5.封片剂：中性树脂+二甲苯。操作流程免疫组织化学染色SP法：1.脱蜡、水化：脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡

2、应溶解。从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；无水乙醇中浸泡3分钟；95%乙醇中浸泡3分钟；70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）；50%乙醇中浸泡3分钟；自来水中浸泡3分钟；1欢迎下载。精品文档梯度脱蜡2.抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W2min。3.丢弃抗原修复液，

3、将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。5.3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)；6.PBST洗3次各3分钟(过三缸)7.滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。8.甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后

4、需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。9.PBST洗3次各3分钟；10.滴加兔或鼠二抗一滴，先滴辅助剂，再滴二抗，之间用PBST洗三次，每次3min，每次室温各静置15分钟；所用试剂盒为中杉金桥2欢迎下载。精品文档的超敏二步法免疫组化检测试剂。11.PBST洗3次各3分钟；12.DAB显色几秒至几分钟，在显微镜下掌握染色程度；DAB为福州迈新试剂，先配现用。13.PBST或自来水冲洗10分钟；14.苏木精复染20秒，自来水分化；15.自来水冲洗30分钟；16.酒精梯度脱水（酒精浓度从低到高，每缸浸泡数秒即可）、透明、封片、镜检。3欢迎下

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