生物化学实验葡萄糖氧化酶法测定血糖含量.doc

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1、.....葡萄糖氧化酶法测定血糖含量【目的】1．掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验方法。2．熟悉葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验原理。【原理】葡萄糖氧化酶（GA）对β-D-葡萄糖的特异性的很强。溶液中的葡萄糖有α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖两型，二者处于动态平衡。当β-D-葡萄糖不断受酶催化而减少时，α-D-葡萄糖便依靠平衡移动，全部转变为β-D-葡萄糖参与反应。GA催化β-D-葡萄糖分子中的醛基氧化生成葡萄糖酸和H2O2，后者在过氧化物酶（PA）作用下放出氧，其可将色原性氧受体“4-氨基安替吡

2、啉偶联酚”的酚氧化，并与4-氨基安替吡啉缩合生成红色化合物，其反应如下。于505nm与同样处理的标准葡萄溶液比色，可测得葡萄糖含量。【器材】1．分光光度计2．恒温水浴.....c.....3．微量加样器4．刻度吸量管5．中号试管【试剂】1．0.01mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液无水Na2HPO418.5g和KH2PO45.3g溶于800ml蒸馏水中，用少量1mol/L的NaOH或HCl调pH至7.0，再加蒸馏水稀释至1L。2．酶试剂取GA1200单位、PA1200单位，4-氨基安替吡啉10mg、

3、叠氮钠100mg，加上述磷酸盐缓冲液至80ml左右，调pH至7.0，再加同上缓冲液至100ml，混匀。冰箱保存可稳定3个月。3．酚试剂酚100mg溶于100ml蒸馏水中。因酚易在空气中氧化成红色，可先配制成50g/dl，贮棕色瓶中，用前稀释。4．酶-酚混合试剂将试剂2、3等量混合。冰箱保存可稳定1个月。5．葡萄糖标准贮存液（20mg/ml）无水D-葡萄糖于80℃烤箱干燥恒重，冷却后，称取2.0g以0.25%苯甲酸溶解、稀释定容至100ml。6．葡萄糖应用标准液（100mg/dl）取葡萄糖标准液5m

4、l，加0.25%苯甲酸溶液稀释定容至100ml。7．蛋白沉淀剂溶解Na2HPO410g、Na2WO410g、NaCl19g于800ml蒸馏水中，加入1mol/LHCl125ml，加蒸馏水至1000ml混匀。【操作】1．血浆直接测定.....c.....取试管3只，标明测定、标准、空白，分别加入血清20μl，磷酸盐缓冲液20μl，然后各管均加酶-酚混合剂各3ml，混匀后将3管同时置37℃水浴保温15min，到时取出冷却。用505nm波长，以空白管调整零，读取各管吸光度值。2．全血去蛋白血滤液测定取蛋

5、白沉淀剂1ml加全血50μl混匀，放置7分钟后，离心取上清0.5ml于测定管；取蛋白沉淀剂1ml加葡萄糖应用标准液50μl，混匀后从中取0.5ml于标准管；另取蛋白沉淀剂0.5ml于空白管。以上三管各加酶-酚混合试剂3ml，各管分别混匀同时放入37℃水恒温箱浴保温15min后，取出如前比色测定。【计算】血糖浓度（mg/dl）＝血糖浓度(mmol/L)＝【注意事项】1．葡萄糖氧化酶法测糖，色原性氧受体种类较多，以往曾多用邻联茴香胺等，因其有轻微致癌作用，现已很少应用。本实验介绍的方法为卫生部临床检验

6、中心所推荐，该法测糖显色灵敏且稳定。2．无水葡萄糖结晶属于α-D型，溶于水中，部分葡萄糖发生变旋光作用，形成β型，2小时后α与β比例达成平衡，α型占36%，β型占64%。因此葡萄糖标准液需在葡萄糖溶解2小时后才能应用。3．该酶法测糖特异性高，且干扰测定结果的特质较少。当溶血标本Hb达到1g/dl，黄疸标本胆红素浓度达到20mgr/dl时，都不大影响测定结果。样品中加入抗凝剂或糖分解抑制剂如草酸钾浓度达到20mg/dl、脚素达60mg/dl、NaF达200mg/dl时，均不干扰测定结果。标本中尿素达

7、280mg/dl、甘油三酯达500mg/dl时对测定结果无影响。而维生素C及谷胱甘肽等还原性物质可引起结果的负误差。4．本法测糖的线性围宽，至少可达20mmol/L（360mg/dl）。5．本法测定血糖正常值为70～110mg/dl或3.9～6.1mmol/L。【思考题】.....c.....1．酶试剂为什么要用磷酸盐缓冲液配制，而不用蒸馏水配制？2．试分析影响本实验的因素有哪些，为什么？.....c.....庄子云：“人生天地之间，若白驹过隙，忽然而已。”是呀，春秋置换，日月交替，这从指尖悄然划

8、过的时光，没有一点声响，没有一刻停留，仿佛眨眼的功夫，半生已过。人活在世上，就像暂时寄宿于尘世，当生命的列车驶到终点，情愿也罢，不情愿也罢，微笑也罢，苦笑也罢，都不得不向生命挥手作别。我们无法挽住时光的脚步，无法改变人生的宿命。但我们可以拿起生活的画笔，把自己的人生涂抹成色彩靓丽的颜色。生命如此短暂，岂容随意挥霍！只有在该辛勤耕耘的时候播洒汗水，一程风雨后，人生的筐篓里才能装满硕果。就算是烟花划过天空，也要留下短暂的绚烂。只有让这仅有一次的生命丰盈充实，才不枉来尘世走一遭。雁过留声