大肠杆菌群检测方法.doc

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1、大肠杆菌群检测方法：用平板涂布法将样品稀释后（每个水样做3个浓度）涂布到伊红美蓝培养基后，待长出菌落，观察符合特征的群落，计算菌落数目，从而求出总数目。{培养基及试剂配制}------伊红美蓝培养基1.成分：　　蛋白胨10g　　乳糖10g　　磷酸氢二钾2g　　琼脂20~30g　　蒸馏水1000ml　　2%伊红水溶液20ml　　0.5%美蓝水溶液13ml2.　配制方法：先将琼脂加至900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH为7.2~7.4。趁热用脱

2、脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min，冷却备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。1．称量按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全

3、溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。3．调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度

4、计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。{实验步骤}1.涂布平板法：1以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。以8000-10000r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。2用1mL灭菌吸管吸取1:

5、10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。3另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。4.将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养

6、基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。1.菌落统计方法-----平板选择法1.细菌常选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落计数标准。每一稀释度采用两个平板菌落的平均数，如两个平板其中一个有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长平板作为该稀释度的菌落数，如片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全板菌落数。2.计数方法 作平板菌落计数时，一般无用肉眼观察，用钢笔或蜡笔在平板上进行点数，必要时可借助于放大镜检查有无遗漏的微小菌落。在计数出各平板

7、菌落数后，求出同一稀释度菌落的平均数。表1平板上菌落数对应的标准差平板上菌落数(个/皿)30≤x≤5051≤            x≤99100≤x≤300标准差(±)10.020.050.0 如三个重复分别为43、32、46，则平均值为40．3，（x-x）2分别为72.9、68．89、32.49，δ＝±7．37，写成±7．4（一）。将检验所得的标准差作修约处理，与标准规定的允许误差作比较，只要越出规定的极限数值都判定为不符合标准要求，示例见表2。表2菌数的测定误差与判定示例稀释平板菌落数(个/皿)检测中允许

8、的误差(δn-1)平板菌落数测定值(个/皿)是否符合要求重复1重复2重复3平均值标准差(δn-1)30≤x≤50±10.042614750.0±0.0(-)符合40605050.0±10.0符合40605150.3±0.0(+)不符37635050.0±13.0不符51≤x≤99±20.061868276.3±3.4(+)符合57554953.7±4.2(-)符合906310285.0