免疫检测法及其应用课件.ppt

《免疫检测法及其应用课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、免疫酶技术及其应用——ELISA1.酶联免疫法ELISA50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)。它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniqu

2、es)的基础上发展起来的一种免疫测定技术。2.免疫标记技术免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定.3免疫酶技术免疫酶技术(enzymeimmunoassay)：是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。就是利用酶标记抗体或抗原，以检

3、测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶（AP）。.4基本原理①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物

4、，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。.5酶联免疫法ELISA.6.7实验材料ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的材料：1.固相的抗原或抗体2.酶标记的抗原或抗体3.酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。4.相应的检测仪器..8检测方法1。夹心法双抗体夹心法测抗原（常用）双抗原夹心法测抗体2。间接法测抗体（常用

5、）3。竞争法竞争法测抗原竞争法测抗体4。捕获包被法测抗体5。亲和素-生物素ELISA法.9双抗体夹心测抗原.10双抗体夹心测抗原待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单价抗原的测定。.11双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定

6、。乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗原。.12间接法测定抗体.13间接法的特点本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。.14竞争法测抗原.15竞争法测抗原（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应，

7、孵育洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。.16竞争法测抗原◆如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。◆如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。◆参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与固相抗体的结合最充分。.17竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时

8、，可用此法检测特异性抗体。标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。.18捕获包被法测抗体样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法。先将所有样品IgM（包括特异