PCR的经验与教训课件.ppt

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1、PCR的经验总结——中心实验室内容提要：PCR的简介PCR的原理PCR的操作步骤PCR的结果分析相关PCR技术简介PCR的简介：年KaryMullis发明1985年开始有文章发表1993年获诺贝尔奖广泛用于分子生物学领域PCR的简介：聚合酶链式反应，简称PCR（PolymeraseChainReaction），指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。PCR的原理：P

2、CR的操作步骤标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物各200μmol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100μlPCR的反应流程：温度与时间的设置：变性温度与时间：一般93℃～95℃，1min足以使模板变性，若低于93℃则需延长时间，但温度过高对酶的活性有影响。引物10～100pmol退火(复性)温度与时间：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适

3、退火温度的起点较为理想。按下公式计算：Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值－（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。一般为30～60s。延伸温度与时间：A.延伸温度：一般选在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min；3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增，但是对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些

4、。B.循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，主要取决于模板DNA的浓度，一般选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCR的结果分析目的基因starPCR扩增产物的片段长度大小为187bp,电泳的条带也在187bp左右，表明扩增产物是我们的目的条带，并且没有非特异性条带，无引物二聚体。PCR常见问题与对策PCR反应的关键环节有：①模板核酸的制备②引物的质量与特异性③酶的质量及纯度④PCR循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。问题一：酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够

5、而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。Mg2+浓度:Mg2+浓度过低影响PCR扩增产量甚至PCR扩增失败而不出扩增条带变性：退火温度太高，延伸时间太短靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。问题二：无扩增产物现象：对照有条带，而样品无原因:1、模板:含有抑制物，含量低2、Buffer对样品不合适3、引物设计不当或者发生降解4、反应

6、条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2、更换Buffer或调整浓度3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4、降低退火温度、延长延伸时间问题三：PCR产物量过少现象：有条带，但产物量过少原因:1、退火温度不合适2,、DNA模板量太少3、PCR循环数不足。4、引物量不足5、延伸时间太短6、DNA模板中存在抑制剂对策：1、以2℃为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度2、增加DNA模板量3、增加反应循环数4、增加体系中引物含量5、以1kb/分钟的原则设置延伸时

7、间6、确保DNA模板干净问题四：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR2、适当降低模板或引物浓度3、适当减少酶量4、降低镁离子浓度5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法6、减少循环次数阳性对照marker问题五：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1、模板不纯2、Buffer不合适3、退火温度偏低4、酶量过多5、dNTP、Mg2+浓度偏高6、循环次数过多对策：

8、1、纯化模板2、更换Buffer3、适当提高退火温度4、适量用酶5、适当降低dNTP和镁离子的浓度6、减少循环次数问题六：杂带现象：扩增产物出现多条带原因：1、引物用量偏大或引物的特异性不高2、模板量过多3、酶的用量偏高或酶的质量不好