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1、实验报告生命科学中的细胞模型姓名：龙珍学号：院系：药学院专业：药理学提交日期：2012年3月31日实验一ＭＴＴ法测定药物对细胞生长的抑制作用实验原理：ＭＴＴ比色法原理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的ＭＴＴ还原为蓝紫色的结晶甲臜。后者结晶产物的量与活细胞数目成正相关，而死细胞或红细胞没有此功能。结晶用ＤＭＳＯ、无水乙醇、酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长为490ｎｍ进行比色,所检测的吸光值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。实验步骤：贴壁细胞消化和吹打(加1ml0.5%胰蛋白酶并轻摇使其遍布所有细胞表面至镜下观察发现胞质回缩、间隙增大停止,倒掉,加入含小牛血清的培养液,反复吹打至瓶壁
2、上无贴壁细胞为止。)计数与分板(取20ul细胞悬液于计数板计数,用1640培养液调整使其细胞数约为1×105个/ml,在96孔培养板中加入细胞悬液每孔100ul,共18个,培养箱孵育12h。)→→加药与孵育(于培养板中分别加入浓度为0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg/ml环磷酰胺注射液各100ul,每组重复3孔,设空白对照组3孔各100ul,孵育2~3小时。)MTT显色(每孔加MTT20ul，3小时候弃上清，每孔加DMSO100ul。)→→酶标仪测定(490nm处测其吸光度实验结果及讨论:1.不同浓度药物的生长抑制率如下浓度（ug/ml）吸光度（x±s）抑制率（%）存活率（
3、%）00.±0.01000.10.±0.0086635.333764.66630.20.±0.14.974885.02520.40.376±0.36.735863.26420.80.±0.55.973144.02691.60.±0.65.058934.94112.细胞存活率-药物剂量对数图IC50=679.218ug/ml3.讨论：加药之前细胞贴壁效果不是很好，分布不太均匀，个别孔细胞有点聚集，加MTT之前药物抑制作用明显，尤其体现在是浓度为1.6mg/ml组。浓度为0.5mg/ml抑制相对明显，其他孔在形态上看不到太明显现象。加DMSO之后颜色对比明显，并且梯度效果比较好，平行孔
4、间颜色较均匀，而且浓度为0.4ug/ml的颜色和其它孔之间也有区别，能够体现出抑制作用。最后通过酶标仪测得的OD值和上述观察到的现象较吻合。.前面已经说到细胞的贴壁效果不是很好，所以不能够完全判定药物的抑制作用，因为如果孔内的细胞状态不好也有可能导致细胞死亡。实验二HE染色法观察药物作用细胞后的形态学变化实验原理：HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞微细结构通过颜色而改变它的折射率,从而在光镜下能清晰显示出细胞图像,染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。实验步骤：1.样品制备:胰酶消化贴
5、壁生长细胞,调整细胞浓度为1×105个/ml,每孔2ml加于6孔板,加盖玻片,加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次。2.样品固定:95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。3.染细胞核:苏木精染色5-10min后自来水水洗。4.染细胞质:伊红染色1-2min后自来水水洗。5.脱水、透明:70%，95%，100%乙醇逐级脱水,二甲苯透明,吹干。6.封片:中性树脂封片。实验结果及分析:这是空白对照，可以看到细胞核细胞浆的染色比较漂亮，细胞核中的核仁数目是正常的，细胞核较完整，并且可以看到有个别细胞的细胞核皱缩，说明处于死亡状态。这是浓度为0.1mg/ml组，这组的药物抑制
6、作用不是很明显，几乎与空白对照差不多。这组是浓度0.2mg/ml，药物抑制作用有体现，并有一处细胞核破碎，可看到有部分细胞核皱缩，这组的染色非常的漂亮。浓度为0.4mg/ml组，这组的细胞质染色较浅，并且看不清药物的抑制作用。浓度为0.8mg/ml，这一组的染色效果很好，但是也看不到药物的抑制作用，反而可以看到有很多的细胞正处于分化状态。（已经做标记）药物浓度1.6mg/ml，这组的细胞核染色较浅，整体上看不到抑制作用，并有个别细胞核进行分裂。综上所述，药物对细胞的抑制作用不明显，并且体现不出浓度趋势，但是整体的染色效果还算可以。实验三吖啶橙荧光染色法观察细胞形态学的变化实验原理：
7、吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在蓝色光或紫外光的激发下，DNA和RNA都会激发出荧光，活细胞经过固定，染色后细胞DNA成亮绿色，核仁和散布在细胞质中的RNA成橘红色，胞质的其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因为物质就够发生变化，其细胞核成暗绿色，细胞质也是成暗绿色。实验步骤：胰酶消化贴壁细胞,调整细胞浓度为1×105/ml,每孔2ml加于6孔板,加盖玻片,加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次,除去血清→95%乙醇固定15~30min→1%
