CRISPR-Cas系统与植物基因编辑课件.pptx

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1、CRISPR-Cas系统与植物基因编辑Cas9目录CONTENTS01CRISPR-Cas9基因编辑技术02CRISPR-Cas9与植物基因编辑03四种介导的植物基因编辑技术04参考文献CRISPR-Cas9基因编辑技术01CRISPR/Cas的分类CRISPR/Cas9技术优势CRISPR/Cas9作用原理CRISPR/Cas结构基础CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas结构基础CRISPR/Cas系统由多个重复序列(repeat)与非重复间隔序列(spacer)构成的R-S结构及编码Cas的基因操纵子组成，其中

2、R-S结构能够特异性识别外源性DNA，并由类似于启动子的CRISPR前导序列起始转录生成crRNA前体。Cas基因家族负责编码具有多种功能的CRISPR相关蛋白质，并通过tracrRNA(trans-activatingcrRNA)将crRNA前体修饰为成熟的crRNA并与crRNA协同作用，共同构筑细菌的免疫屏障。CRISPR-Cas9基因编辑技术细菌体内的CRISPR/Cas9免疫系统的作用机制可分为以下三步：CRISPR间隔序列的获取、crRNA前体的转录与crDNA的加工、crRNA与tracrRNA及Cas9蛋白结合成复

3、合体对外源性DNA进行剪辑。。根据该机制，Wiedenheft等设计出的CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术的核心过程为：根据crRNA与tracrRNA的二聚体结构设计出sgRNA，将之与Cas蛋白结合，引导Cas蛋白与特定基因位点结合并进行剪辑。该设计将CRISPR/Cas9免疫系统简化为sgRNA与Cas蛋白的复合体，只需将其导入细胞，即可对目的基因片段进行定点编辑，这极大地简化了CRISPR/Cas9基因编辑技术。CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas作用原理由tracrRNA-crRNA-Cas9

4、复合物识别外源性DNA，其中Cas9蛋白在crRNA互补链PAM元件上游3nt与非互补链PAM元件下游的3~8nt处对DNA双链进行剪辑。类型IICRISPR-Cas9基因编辑技术多个Cas蛋白与crRNAs结合形成cascade(CRISPRassociatedcomplexforantiviraldefense)-crRNA，其识别外源DNA与含有PAM(protospaceradjacentmotifis)元件的位点特异性结合，并介导Cas3蛋白对目标DNA进行剪辑。类型I不需要PAM的情况下，Cas6/Cas10作用于cr

5、RNA前体，形成crRNA并与之结合后，识别并破坏外源性DNA。类型IIICRISPR/Cas分类CRISPR/Cas技术优势CRISPR-Cas9基因编辑技术与ZFN和TALEN等相比，CRISPR/Cas9系统能更好地识别靶基因，且CRISPR/Cas9系统由crRNA和Cas9蛋白组成，结构简单，仅需构建一对引物。因此该基因编辑技术具有更高的编辑效率、更简单的操作、成本低、编辑范围广等优势。CRISPR-Cas9与植物基因编辑02双子叶植物中的应用CRISPR-Cas9基因编辑技术21单子叶植物中的应用CRISPR-Cas9

6、基因编辑技术拟南芥烟草大豆番茄马铃薯15324CRISPR/Cas技术在双子叶植物中的应用CRISPR-Cas9基因编辑技术拟南芥拟南芥作为模式植物，对其研究最多也基本是最先开始的。2015年，Ma等制备了由AtU3和AtU6启动子驱动的1-3个sgRNA表达盒的4个基于pYLCRISPR/Cas9P35SH的构建体，用于在拟南芥中靶向基因；使用农杆菌浸润（花卉浸渍）方法转化，而后分析了拟南芥T1代的靶向编辑情况，在118个测序位点中，检测到42个（35.6%）突变，且这些突变是可遗传的。CRISPR-Cas9基因编辑技术烟草烟草

7、也是常用的模式植物。2015年Gao等也对PDS基因进行了实验的同时，还对独脚金内酯转运蛋白PDR6基因进行定点编辑，在烟草的原生质体中获得16.2%-20.3%的突变率。在烟草中的基因定点编辑无论是叶片还是原生质体都有取得突变，但没有获得可供稳定遗传的植株，需要进一步的研究来解决。CRISPR-Cas9基因编辑技术大豆大豆是重要的粮食作物.2015年Sun等针对大豆的Gm06g14180、Gm08g02290和Gm12g37050基因设计靶位点，分别用拟南芥的AtU6启动子和大豆的GmU6启动子驱动gRNA，获得了3.2%-20

8、.2%的突变率且使用大豆GmU6启动子比拟南芥AtU6启动子的打靶效率更高；其内源的启动子也可以驱动gRNA实现定点突变。结果证明CRISPR/Cas9系统可以对大豆的外源导入基因及内源基因进行定点基因编辑。CRISPR-Cas9基因编辑技术番茄番