Westernblot详细操作过程.docx

《Westernblot详细操作过程.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、Western-blot详细操作过程————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：WesternBlotWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的

2、第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。实验器材和试剂：一．蛋白提取试剂1.10%SDS裂解液：称取10gSDS粉末加入双蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室温保存。2.RIPA裂解液1ml裂解液工作液配方：10ul100mmol/LPMSF(1mM)0.2ul10mg/mlAprotinin(2ug/ml)试剂盒RIPA5.0ul1mg/mlLeupeptin(5ug/ml)0.98

3、48ml裂解液0.5ml裂解液工作液配方：5ul100mmol/LPMSF(1mM)0.1ul10mg/mlAprotinin(2ug/ml)2.5ul1mg/mlLeupeptin(5ug/ml)0.4924ml裂解液PMSF必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/LPMSF：17.4mgPMSF粉末溶于1ml异丙醇(AR)，分装250ul每管后－20℃保存。使用终浓度为1mmol/L。【PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦

4、眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。】二．蛋白定量试剂：1.BCA蛋白定量试剂盒2.10ml0.9%的生理盐水（90mgNaCl溶于10ml去离子水中）三．上样用试剂：6×SDS上样缓冲液：取一个离心管，秤取2.0gSDS粉末，6mg溴酚蓝(BromopHenolblue;Albutest)粉末，然后用枪头加入5mL1.5mol/LTris-HCl(pH6.8)，用移液管加入10mLGlycerol(甘油，丙三醇)，枪头加入2mLβ-mercapteethanol（β-巯基乙醇）充分混匀，加双蒸水定容至20ml，涡旋溶解

5、。4℃避光保存。四．电泳工作液：1.1.5mol/LTris-HCl缓冲液：（三（羟甲基）氨基甲烷）称取18.171gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。2.1.0mol/LTris-HCl缓冲液：称取12.114gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。3.0.5mol/LTris-HCl缓冲液：称取6.057gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。

6、4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。4.10%APS：(一周内使用，最好新鲜配置)称取0.5gAPS粉末，加入双蒸水至5mL，充分溶解，4℃保存。5.10%SDS:秤取10gSDS粉末溶于100ml双蒸水中，可50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用5.分离胶（下层胶）：分离胶5%7.5%10%12%15%30%acrylamide/bis1.68ml2.5ml3.35ml4.02ml5ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml10%SDS100ul100ul100ul100

7、ul100ulDdH2O5.474.65ml3.8ml3.13ml2.15ml10%APS（灌胶时再加）50μL50μL50μL50μL50μLTEMED（灌胶时再加）5ul5ul5ul5ul5ul分离蛋白分子量57-212KD36-94KD20-80KD12-60KD10-43KD混匀后在室温下静置15min，然后加入5ulTEMED即为分离胶，即可灌胶。6.4%浓缩胶（上层胶）：0.7mL30%Acr/Bis；1.5mL0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)；60μL10%SDS；3.6mL双蒸水混匀后加入50μL10%APS和5μLTEMED（灌胶时

8、再加）。7