文献汇报PPT(一)课件.pptx

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1、Effectsofshort-chainacyl-CoAdehydrogenaseoncardiomyocyteapoptosis短链酰基辅酶A脱氢酶在心肌细胞凋亡中的作用学生姓名：廖秀楚专业班级：18级本临14班TRADITONRESULT132CONTENTSCONCLUSION01TRADITON方法:一、以tBHP刺激心肌细胞建立凋亡模型。检测细胞存活率、SCADmＲNA和蛋白表达、SCAD活性以及游离脂肪酸含量变化。二、采用SCAD的最优干扰序列siＲNA-1186进行干扰，观察其对心肌细胞凋亡的影响

2、。目的:研究SCAD在心肌细胞凋亡中的变化，探讨其与心肌细胞凋亡之间的关系。研究概述04030201采用siＲNA对SCAD进行干扰，心肌细胞出现了明显的病理性肥大，表明SCAD的表达失调在病理性心肌肥大中具有重要意义。然而，SCAD在心肌细胞凋亡中的作用尚不清楚。前期研究中，采用定量蛋白质组学技术比较了16周龄自发性高血压大鼠和血压正常大鼠的心肌蛋白质组，首次发现SCAD在自发性高血压大鼠肥大心肌中的表达明显降低。进一步研究显示，在病理性心肌肥大的体内外模型中SCAD的表达和酶活性均显著下降。心肌是耗能最多的

3、组织之一。正常心肌能量的60%～90%由脂肪酸氧化提供。因此，线粒体脂肪酸β氧化对于维持心肌能量代谢有重要意义。研究表明，心肌细胞凋亡是心肌肥厚向心力衰竭转化的重要机制，在肥大后期，由于心肌细胞的不断丢失，使心肌组织合胞体的功能逐渐受损，心功能逐渐降低，最终导致心力衰竭。研究背景DCPIP：2，6-二氯酚靛酚(2，6-dichlorophenolindophenol)SCAD：短链酰基辅酶A脱氢酶(short-chainacyl-CoAdehydrogenase）酰基辅酶A脱氢酶家族中的一员，特异性地分解短链酰

4、基辅酶A底物，是脂肪酸β氧化的第一个限速步骤，是脂肪酸氧化的关键酶。生理情况下，进入线粒体的酰基辅酶A在相应的脱氢酶作用下脱氢，开始脂肪酸β氧化循环，从而产生大量能量，供给心肌需要。FAD：黄素腺嘌呤二核苷酸(flavinadeninedinucleotide)tBHP：叔丁基过氧化氢(tert-butylhydroperoxide)AbbreviationsPMS：硫酸甲酯吩嗪(phenazinemethosulphate)1、细胞培养2、流式细胞术3、免疫细胞化学染色4、MTT比色法5、Real-timeP

5、CR6、Westernblot（蛋白质印迹）7、酶活性测定8、流式细胞术实验技术02RESULT1.心肌细胞的选择采用乳鼠心肌细胞，改良法分离取1～3dSD乳鼠心脏，0.08%胰蛋白酶冰上冷消化20min后，37℃恒温水浴消化4min培养心肌细胞，密度培养将乳鼠心脏消化成为单细胞悬液，收集细胞沉淀重悬后差速贴壁1h去除成纤维细胞多次消化接种于培养皿，37℃、5%CO2培养箱中培养，并加入BrdU(0.1mmol/L)抑制成纤维细胞生长取上清心肌细胞纯度可达95%以上，符合实验要求α-actin抗体的免疫细胞化学

6、染色2.tBHP是一种脂质过氧化物，与H2O2性质相似，均可用来诱导构建细胞氧化损伤模型.MTT结果显示tBHP可以明显降低细胞存活率，且具有一定的浓度与时间依赖性。本研究选择200μmol/LtBHP，刺激6h作为后续RNA干扰部分的实验条件。（常采用细胞存活率为40%～60%的处理因素来选择诱导凋亡）3-1.实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法;是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对P

7、CR进程进行实时检测.将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。95℃10s，90℃5s，循环50次95℃15s，60℃1h，65℃30s，循环61次反应程

8、序3-2.实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法;是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测.Real-timePCR结果显示，随着tBHP处理浓度和时间的增加，心肌细胞内SCAD的mRNA表达明显下降4-1.经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固