分子生物学RTPCR课件.pptx

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1、第二部分RT-PCR的原理，方法及琼脂糖凝胶电泳结果分析RT-PCR技术背景基因组DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白质产物（1）基因的表达（2）PCR技术变性退火延伸（3）逆转录酶和RT-PCRRT-PCR技术目的通过反转录(reversetranscription，RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度RT-PCR实验原理m-RNAc-DNAPCR产物RT(反转录)PCR这里修改标题RT-PCR实验原理RT-PCR实验步骤——提取总RNATR

2、Izol法抽提总RNA1、细胞1×107或组织100mg,加1mlTRIzol(细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟。2、氯仿1/5体积（0.2ml），颠倒混匀10下，室温5分钟。3、4℃，离心12000g，15分钟。4、转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟。5、4℃，离心12000g，10分钟。6、弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。7、4℃离心7500g，5分钟。8、弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20μl（可在55

3、-60℃水中，<10分钟助溶）。9、紫外分光光度计测总RNA浓度。RT-PCR实验步骤——反转录（RT）逆转录反应：1、RNA1-5μg,加入适量的DEPC水至11μlOligo(dT)151μl混匀，离心，70℃10min。2、立即冰水浴。10XPCRbuffer2μl25mMMgCl22μl10mMdNTPmix1μl0.1MDTT2μL混匀，离心，42℃50min。3、95℃10min（破坏MLV,终止反应），4℃保存。RT-PCR实验步骤——聚合酶链反应(PCR)PCR反应：反应体系：总体积20μl(50μl)试剂浓度体积TaqBuffer10×(5μl_)dNTP10mM(0.5

4、μl)上游引物10pmol/μl(1μl)下游引物10pmol/μl(1μl)cDNA模板(1-10μl)Taq酶2.5U/μl(1μl)DEPC水20μl-4.3μl混匀28-36循环，4℃保温RT-PCR实验步骤——琼脂糖凝胶电泳加1-10μlPCR产物与上样缓冲液（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。成像系统进行成像分析。琼脂糖凝胶电泳结果分析DNA分子中含有磷酸基和碱基，在生理条件下，磷酸基中的羟基发生解离，因此DNA带负电在电场中向正极移动。数量分析：条带的宽度、荧光的亮度质量分析：纯度，分子量琼脂糖凝胶电泳结果分析