组培实验外植体选择处理及接种培养教学内容.ppt

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1、4无菌操作技术一、外植体的选择与处理二、外植体的接种和培养三、试管苗的驯化与移栽四、常见问题与解决措施一、外植体的选择与处理（一）外植体的选择（二）外植体的处理（三）污染问题及解决措施（一）外植体的选择植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。1.选择优良的种质无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。2.选择健壮的植株组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫

2、的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。3.选择最适的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高；花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。4.选取适宜的大小建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm--1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。(二)外植体的处理外植体在接种前

3、先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。常规的表面灭菌处理方法①把材料放进75%的酒精中约30～60s。②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。③无菌蒸馏水冲洗3～5次。④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润剂，能增强灭菌效果。常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间效果次

4、氯酸钠2—3易5—30很好次氯酸钙2易5—30很好漂白粉饱和浓度易5—30很好氯化汞0.1—1较难2—10最好酒精70—75易0.2—2好过氧化氢10—12最易5—15好溴水1—2易2—10很好硝酸银1较难5—30好抗菌素4—50mg/L中30—60较好（三）污染问题及解决措施1.污染的原因污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。污染的原因：从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即可发现。

5、原因：材料带菌培养基灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10天才能发现。原因：周围环境不清洁超净工作台的过滤装置失效培养用器皿的口径过大为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。2.污染的预防措施发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。现就根

6、据污染途径，阐述污染的几种预防措施。（1）防止材料带菌①用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水促使抽枝，以这种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。②选择合适的时间去田间采取外植体避免阴雨天去田间采取外植体。在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，要剥去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织

7、，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。（2）外植体的灭菌①多次灭菌法：一是将切好的外植体放入2.5%的次氯酸盐溶液中消毒20-30min；二是在无菌蒸馏水中冲洗3次；三是将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；四是第二天再将外植体用2.5%次氯酸钠灭菌20-30min，然后用蒸馏水洗3次。对层积过的种子可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌。②对易污染而难灭菌的材料用多种药液交替浸泡消毒：一是将外植体用洗涤液充分洗净并修整干净；二是将材料放入75%洒精中灭菌30-60s；三是在1：500的RoccalB（一种商