荧光光谱教学提纲.ppt

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1、第3讲荧光光谱荧光是怎么产生的？有什么用途？常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？荧光强度和物质浓度是什么样的关系?还有哪些因素会影响到荧光强度？荧光光谱的有哪些光谱参数？有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么用途？荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光和发射光频率之差称为斯托克频移。满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽，从X射线到红外光谱区仍然是荧光。其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等）也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如：钞票防伪，日光

2、灯管，萤火虫发光。1.荧光介绍1）荧光产生及其物理机制S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时，荧光分子处于激发态。b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射跃迁过渡到低的能级。c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的作用，以及能量转移，过渡到低的能级d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态

3、，平均寿命约为10ns左右。e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。如电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。荧光发光分为内源荧光和外源荧光。外源荧光应用很广，如染料结合作为荧光探针与蛋白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分子间距离等。荧光寿命和量子产率：荧光猝灭：荧光能量共振转移：时间分辨荧光光谱：荧光各向异性：荧光量子点标记，转基因荧光标记双光子荧光光谱2）荧光的应用2.常

4、用荧光光谱1）荧光的激发光谱，发射谱激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。2).荧光光谱的特征a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能

5、级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似（振动波函数一样）；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。3.荧光光谱仪及使用技术光源激发单色器样品池检测器发射单色器检测器荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背景是没有入射光，是“暗背景”，因此灵敏

6、度更高。1）荧光光谱仪I0dF薄层吸收的光强为：溶液发出的荧光光强正比于吸收光强。如果kcl<<1，进行展开，有2）荧光强度和溶液浓度的关系样品池长度通常为1cm，因此荧光强度为荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。原因可能是：a浓度增加，分子碰撞机会增加，增加了非辐射损耗。b溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光）c吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收）d仪器原因3）.荧光光谱的环境效应4.荧光光谱参数1）荧光光谱参数：（1)荧光寿命和荧光量子产率去掉激发光以后，荧光强度并不是立即消失，而是

7、以指数形式衰减。定义荧光强度降低到激发状态最大荧光强度的1/e所需要的时间称为荧光寿命。荧光寿命是个很重要的参数，可以不再对荧光的绝对强度进行测量。荧光寿命方程：公式中的τ即为荧光寿命荧光寿命和量子产率示意图Q为量子产率，为荧光发射速率，knr为非辐射转移速率,τn为荧光自然寿命.通常量子效率和波长相关，但生化的荧光通常和波长无关。（2).荧光各向异性荧光偏振：荧光偏振（参数）：p=(F∥-F⊥)/(F∥+F⊥)荧光各向异性:γ=(F∥-F⊥)/(F∥+2F⊥)XYZF⊥F∥μaμeIp和同时描述荧光偏

8、振。从对称性考虑，Fx=Fy,通常用描述荧光偏振各向异性与偏振度转换：5.荧光实验方法及其用途荧光猝灭荧光各向异性荧光能量共振转移时间分辨荧光光谱荧光标记双光子荧光光谱荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。狭义主要指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。原因：溶剂猝灭剂和荧光物质之间发生相互作用而引起荧光效率降低或激发态寿命缩短，导致强度降低。卤素离子、重金属离