PCR实验教学组织知识讲稿.ppt

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1、PCR特异性扩增DNA片段北京四中赵晓刚课标标准具体内容标准活动建议尝试PCR（PolymeraseChainReaction）技术的基本操作和应用用某一片段进行PCR扩增一、实验室准备二、实验准备三、教学组织一、实验室准备1、PCR仪（1）美国MJRESEARCHMinicycler（2）德国Eppendorf产品一、实验室准备2、移液器（1）德国Eppendorf（2）芬兰ThermoScientificFinnpipette一、实验室准备3、灭菌锅一、实验室准备4、离心机一、实验室准备5、电泳仪北

2、京六一仪器厂川布兰公司一、实验室准备二、实验准备三、教学组织二、实验准备（课前）（一）PCR准备工作1、人性别鉴定试剂盒（克隆Y染色体SRY基因）组成成分含量加ddH2O量ddH2O220μL10Xbuffer+MgCl230μLdNTPmixture7μL引物Ⅰ0.1OD40μL引物Ⅱ0.1OD40μLTaqDNA聚合酶5μL（1）在引物管中各加入40μLddH2O，充分溶解，离心备用（2）4位同学一组，上课前15分钟，每个实验台上摆放好一个两面板（上面要摆上2个灭菌的0.2mL离心管），一个

3、冰盒（含上表试剂），2支移液器，一盒灭菌10μL吸头，一把剪刀，一个废液缸（烧杯），1记号笔。4人一组的仪器和试剂2.学生操作10Xbuffer4μLdNTPmixture0.8μL引物Ⅰ1μL引物Ⅱ1μLddH2O12.6μLTaqDNA聚合酶0.6μL1uL12.4uL教师与提供试剂公司进行协调，技术人员做预实验3.PCR程序设计循环温度时间循环次数预变性94℃30s变性94℃20s25次退火52℃20s延伸72℃20s保温72℃30s（二）电泳相关实验准备（二）电泳相关实验准备（二）电泳相关实验准

4、备1、琼脂糖凝胶电泳试剂盒组成成分分装量琼脂糖4×0.25gDNAMarker30μL50×电泳缓冲液20mL核酸荧光染料80μL6×LoadingBuffer80μL0.5mL的离心管1包（25个/包）（1）将50×电泳缓冲液稀释成1×电泳缓冲液（即20mL50×电泳缓冲液中加入980mL蒸馏水，稀释成1L的1×电泳缓冲液）（2）制备2块胶备用（3）将6×loadingbuffer和核酸荧光染料各取30μL，充分混匀，然后取24个0.2mL离心管，每管分2μL的混合物，置于学生的两面板上备用一、实验室

5、准备二、实验准备三、教学组织（2节课时间）三、教学组织（2节课时间）（一）第1节课1、PCR条件和原理（10min）2、移液器的使用（5min）3、配置反应体系（10min）4、PCR程序设计和反应5、教师将反应后体系-20℃保存三、教学组织（2节课时间）（二）第2节课1、电泳原理（5min）2、胶的制备（5min）3、染色、点样（5min）4、电泳约20min—（继续按进度讲课或学生观摩）5、观察（下课前5min）三、教学组织（仅供参考）问题1.体内DNA复制的条件？问题2.体内DNA复制的特点？问题

6、3.如果只复制特定DNA片段（Gene2）呢？一、PCR的原理和条件（10min）(一)、PCR的原理和条件1.原理变性退火延伸2.条件模板DNA引物（保证复制的精确起始）4种脱氧核糖核苷三磷酸DNA聚合酶(二)、PCR实验操作1.实验目的PCR扩增人类性别决定基因SRY，并检测2.实验材料和器具2.1男生2根带有明显毛囊的头发女生2根作对照2.2移液器、吸头、离心管每取一种试剂更换枪头,每位同学尝试用移液器一次2.3人性别鉴定试剂3.配制反应体系（10min）A10Xbuffer4μLdNTPmixt

7、ure0.8μL引物Ⅰ1μL引物Ⅱ1μLddH2O12.6μLTaqDNA聚合酶0.6μL循环温度时间循环次数1预变性94℃30s2变性94℃20s25次3退火52℃20s4延伸72℃20s5保温72℃30s4.PCR程序设计（10分钟）B5、教师将反应后体系-20℃保存作业：已知DNA聚合酶合成DNA的速度是1000碱基/min,克隆1500bp基因，75min理论上能合成该基因的数目约是？（已知变性30S，退火30S）230思考：PCR实验结束后如何鉴定是否克隆到SRY基因呢？三、电泳1.原理琼脂糖

8、凝胶电泳常用于DNA、RNA大片段的分离，核酸磷酸基团带负电荷可向阳极移动，在电场驱动力和凝胶阻力作用下，不同分子量的核酸分子迁移率不同。2.实验操作2.2染色、点样B2.3电泳(20min)—观察C2.1制胶ATHANKS