酶工程实验生物工程课件.ppt

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1、本实验共有六个分实验:实验一酵母蔗糖酶的纯化与纯度测定实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度实验三酵母蔗糖酶的结晶（选做）实验四蔗糖酶酶学性质的研究实验五酵母蔗糖酶的固定化实验六酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)细胞膜内侧细胞质，含有少量的糖。外蔗糖酶内蔗糖酶细胞膜的外侧，占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。实验一酵母蔗糖酶的提取与纯化本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、加热除杂蛋白、乙醇沉

2、淀、离子交换柱层析等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行初步检验。有机溶剂分级的原理：有机溶剂分级是利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。其原理是：1、有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引力，使蛋白质溶解度下降；2、有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质的溶解度下降。结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力静电引力大小与溶液的pH值有关，因pH值决定蛋白质的解离程度。NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2

3、COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlost阳离子交换剂样品溶液pH＜pI时，酶带正电荷；阴离子交换剂样品溶液pH＞pI时，酶带负电荷一般样品溶液的pH与酶pI相差一个pH以上样品溶液的pH与酶pI相差越大的，带电荷越多通过逐渐增加洗脱液离子强度的梯度洗脱方式，可使结合在层析柱上的蛋白质按照结合力由小到大的顺序依次被洗出层析柱。SampleapplicationandwashElutionEquilibratio

4、nRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基（DEAE）。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。控制：样品溶液pH＞pI时，酶带负电荷离子交换柱层析的原理：根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技

5、术在分离过程中，以离子交换剂作用为主导。在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是：1、开放性的长链结构、较大的表面积，所以对蛋白质吸附容量大；2、纤维素上离子基团数量不多且排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即可达到分离目的，不致引起蛋白质变3、用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变，所以有利于蛋白质层析。本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基（DEAE）。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。为了

6、确定哪个峰是含目标酶，要进行酶活力的测定；用蔗糖做底物反应一段时间后，检测生成的葡萄糖的量；用尿糖试纸初步检测；用DNS法精确检测。Sucrase（蔗糖酶）glucose＋fructoseSucroseSemi-quantitativeassayofyeastsucraseactivitywithU-Glutest-tapeSucroseglucoseoxidase（葡萄糖氧化酶）gluconicacid＋H2O2（葡萄糖酸）H2O+O2-colouredsubstanceSucrase（蔗糖酶）gluc

7、ose＋fructoseHydrogenperoxidase（过氧化氢酶）colourlesssubstance（无色物质）U-Glutest-tape尿糖试纸DNS法精确检测黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比而葡萄糖生成量又与待测液的酶活力大小成正比。酶活定义：在37℃，Ph4.5，每分钟催化蔗糖生成1μM葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。DNS法测葡萄糖浓度管号操作空白标准

8、葡萄糖浓度梯度样品012345AB葡萄糖标准液mg/ml00.20.40.60.8100蔗糖溶液11111111醋酸buffer11111111待测酶液000000200微升200微升37℃准确反应10min，1mL1mol/LNaOH终止酶促反应水杨酸试剂（DNS）1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml沸水浴精确反应5min,冷却后定容至20mLA540附图：葡萄糖标准曲线为了确定获得的目标酶纯不纯，要进行SDS-