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1、丝素蛋白一、丝素蛋白的结构基础二、丝素蛋白的特点三、丝素蛋白的获取四、丝素蛋白的应用文献一《丝素蛋白作为生物材料的基础研究》蚕丝中的丝素蛋白作为纯天然生物高分子材料用于医用领域已经有很长历史,而将其用于细胞培养的基质和组织工程,是近年来丝素蛋白研究与应用的热点。丝素蛋白完全可以用作细胞生长的表面基质,可替代常用的胶原蛋白。本文尝试应用丝素薄膜作为贴壁依赖型动物细胞的生长表面基质,以研究丝素薄膜作为生物材料在细胞培养上的特性。实验中以猪髋动脉内皮细胞(Porcineiliacarteryendothelialcell,简称PIEC)为模型细胞,同时用
2、酸性成纤维生长因子(aFGF)对丝素薄膜进行处理,以噻唑蓝(MTT)法的细胞计数测定方法,通过与普通培养孔板上的对照实验,观察此细胞株在丝素薄膜表面的粘附与生长等行为,从而检验丝素薄膜的生物相容性,并确定丝素薄膜经aFGF处理后对细胞吸附能力的强化。丝素薄膜的制备:将去蛹蚕茧放入煮沸的5g/L的Na2CO3溶液中,固液比为1∶15(g∶mL),煮沸时间为40min,反复2次,以脱除蚕丝中的丝胶蛋白。煮沸后的丝素蛋白固形物用去离子水反复洗净,在真空干燥箱中20°C干燥24h。所得的丝素蛋白固形物放入500g/L的CaCl2溶液中,固液比为1∶10,煮
3、沸直至丝素蛋白完全溶解(15～30min)。将所得丝素2CaCl2溶液抽滤去除杂质,其滤液在透析膜中不断用去离子水透析2～3d以完全去除CaCl2,得纯净的丝素蛋白溶液。经SDS2PAGE凝胶电泳实验测得,丝素蛋白在溶液中为相对分子质量分布于43000～331131u的连续体系。配制蛋白质浓度为5～15mgömL的丝素蛋白溶液,用移液器注入24孔孔板中,在烘箱中40°C干燥24h以形成薄膜。细胞培养实验前,将U=0.8的酒精注满含有丝素薄膜的孔板或培养孔底部,紫外照射30min以上,以对丝素薄膜进行灭菌。然后在无菌条件下倾倒出酒精,用灭过菌的磷酸缓
4、冲液反复润洗含有丝素薄膜的孔板,以消除酒精对细胞生长的抑制作用。丝素薄膜的酸性成纤维细胞生长因子溶液处理:接种前,用含10%小牛血清的DMEM培养基配置一定浓度的aFGF溶液,无菌条件下用其浸润丝素薄膜24～48h,细胞接种前倾倒尽aFGF溶液。文献2《蚕丝素蛋白及其应用——阐述了丝素蛋白的组成、结构、性质和制备方法,及其综合利用现状》蚕丝由2种蛋白组成,包围在蚕丝外层的是丝胶蛋白,内层为丝素蛋白。不同种类的蚕丝中,丝素蛋白的含量不尽相同,但大体上说,丝素蛋白占蚕丝总质量的70%~80%。组成和结构1.1组成丝素蛋白由18种氨基酸组成,其中有8种
5、是人体所必需的氨基酸。由于种类的不同,柞蚕丝和桑蚕丝的丝素蛋白中氨基酸含量具有明显的差别,详见表1。除了碳、氢和氮元素外,丝素蛋白还含有多种其他元素如钾、钙、硅、锶、磷、铁、铜等,这些元素与丝素蛋白的性能及蚕吐丝的机理等有直接关系。1.2结构丝素蛋白是一种纤维状蛋白,由表层的无定形区和里层的结晶区构成。其中结晶区包括2种结晶形态,分别称为silkI型和silkII型。在silkII中,肽链的链段排列整齐,相邻链段之间的氢键和分子间引力使它们结合的相当紧密,抵抗外力拉伸的能力强,柔软度低,在水中难以溶解,对酸、碱、盐、酶及热的抵抗力较强。无定形丝
6、素中肽链的链段排列不整齐,链段之间的结合力较弱,易溶于水,柔软度高,抵抗外力拉伸的能力弱,吸湿性强,对酸、碱、盐、酶和热的抵抗力较弱。在透射电镜和扫描电镜下观察,丝素纤维的最基本结构单元是直径为10~50nm的微原纤,微原纤聚集成数万纳米的原纤,大约100根原纤再集合成十万纳米数量级的巨原纤,巨原纤再聚集成几百万纳米的丝素纤维。桑蚕丝素蛋白的氨基酸序列已经确定。桑蚕丝素分子羧基末端的非重复区域含有较多的碱性氨基酸,尤其是精氨酸。而柞蚕丝素不仅含有碱性氨基酸,还含有作为细胞粘附座而闻名的三肽序列:精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸。2性质丝素蛋白具有多
7、孔性和较高的吸水回潮率,不溶于水,可溶于高浓度的某些无机盐。丝素蛋白在100℃时开始脱水,从175℃开始逐步失重,颜色由白变黄,至280℃完全变黑,305℃时分解。丝素蛋白分子中因含酚羟基及其他结构,易吸收紫外光而变性。随着照射时间的增加,丝素蛋白泛黄程度也增加,特别是在有水的环境下,泛黄程度加剧。丝素溶液中丝素蛋白的构象为无规则卷曲结构,在45℃下中速干燥固化得到含silk#结构的丝素膜;温度高于45℃时,silkI向silkII转变。丝素溶液干燥固化后的结构不但受温度影响,还与干燥速度、溶液的酸碱度及组成有着密切的关系。长时间常温下干燥的过程中
8、有silkI的形成,但最终会形成稳定的silkII;当干燥速度过快时,即使在50℃以上,仍以无定形结构为主;若溶液干燥初期
