RNA提取-第一步课件.ppt

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1、RT-PCR三部曲RNA提取逆转录为cDNAPCRRNA提取-第一步提取RNA器械的处理玻璃、不锈钢器皿：180度干烤4~6小时（不离人）塑料制品：-高压灭菌，烘干-DEPC水浸泡过夜，捞出沥干水分（很重要），烘干-电泳槽可用0.5M的NaOH浸泡20minRNA提取所需试剂和器皿清单干烤的物品：玻璃器皿：1000~2000ml的大烧杯（浸泡Tip）、100ml的量筒（配乙醇用）、带玻璃塞子的玻璃瓶3个（装异丙醇、氯仿、75%的乙醇）铝饭盒（放ET管）、镊子（夹Tip和EP管用）处理的塑料制品：枪头（1000ul/200ul/20

2、ul）EP管（1.5ml、200ul）EP管盒子（要与枪头配套）制剂：DEPC、Trizol异丙醇、氯仿、乙醇(未开封的)电泳缓冲液、琼脂糖、EBDEPC（焦碳酸二乙酯）DEPC水，A：配制好未消毒；蒸馏水中加入0.1%DEPC，室温搅拌4小时以上至完全溶解。作用：处理RNA提取的器材（不能干烤的物品）浸泡过夜B:配制好已消毒。高压灭菌20分钟，冷却备用。（通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒）作用:配置75%乙醇，溶解RNA防止RNA降解有专门的RNA提取区域：避免人员流动实验人员带口罩、帽子，勤换手套快速操作保证低温环境：降低

3、环境温度、冰上操作（冰盒）、低温离心1Rnase是一种蛋白酶，能够降解RNA。2皮肤、唾液3这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时，要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。什么是RNA酶Rnase?11mlTrizol/孔，室温放置5min，用吸管吹打吸取到EP管中；2加200ul氯仿剧烈振荡15s，室温放置2－3min；312000g低温离心15min;4小心取上层水相,一般400-450ul就足够了（千万不要贪多）！5加入500ul异丙醇摇匀（反复颠倒10次），室温放置10min；612000g低温离心1

4、0min；775％乙醇1ml洗涤沉淀；87500g离心5min；（也可加大离心速度，这样RNA不易被倒掉）9小心弃去乙醇（不要把RNA倒掉），用小Tip吸干净残余的乙醇（底部不要吸的太干，室温干燥5－10min；10加20~30ulDEPC水溶解沉淀。留取6ul，其余立即分装两份冻存（-80度）2ul用于定量，余下用于跑胶电泳---判断RNA完整性和是否有DNA污染新鲜配置的电泳缓冲液电泳时间不要太久，100~120V，10－15min足够了。如何判断RNA的完整性：最理想的RNA降解的RNA是酱紫滴定量1：70（1ul+6

5、9ul的水）