《RNA的提取》PPT课件

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1、反转录和实时荧光定量PCR技术的原理及应用(ReverseTranscriptionandRealtimeQuantitativePCR)泰山医学院动脉粥样硬化研究所宋国华girl_sapphire@hotmail.comRT-PCR逆转录（reversetranscription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。是RNA病毒的复制形式，需逆转录酶的催化。艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。逆转录与反转录严格意义上来说没有什么区别，但是逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细

2、胞内以RNA为模板形成DNA的过程；反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，逆转录在体内，反转录在体外。实验步骤Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端PolyA+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。反转录实验步骤1．

3、电泳和分光光度计定量RNA。2．反转录体系:(20μl)37℃孵育60min3．将逆转录产物进行PCR反应或荧光定量PCR反应。1g单管一步法反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。两步法反转录和PCR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，这可能是因为体系更加单一比较利于PCR的进行。RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-timePCR)。为了与

4、逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitativePCR)或者QRT-PCR(quantitativereal-timePCR)。PolymeraseChainReaction(PCR)一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90℃-95℃）,低温退火（50℃-65℃，1-2min），中温延伸（65℃-75℃）这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。DefinitionofPCR实时荧光定量PCR实时荧

5、光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增

6、产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理-----------扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧

7、光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重

8、现性实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号