现代分子诊断技术课件.ppt

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1、第八章现代分子诊断技术酶联免疫吸附测定DNA诊断系统DNA指纹随即扩增多肽DNA遗传性疾病的分子诊断癌症的分子诊断有效诊断应该具备的条件专一性强。即诊断只对目标分子或某一病原菌产生阳性反应；灵敏度高。是指即使只有微量的目标分子，或是在有很多干扰物质存在的情况下，也能够有效诊断；操作简单。便于进行大规模检测。传统诊断技术传统诊断技术一般包括两个过程：先对病原物质进行培养，培养后分析它的生理学特性再分析鉴定它是那一类的病原物，是细菌、病毒，还是其他物质特点:方法具有有效性，但也具有明显的缺陷，如诊断的成本高、速度慢、效率低；对于无法人工培养的病原物质以及尚未鉴定的病原

2、物，临床诊断非常困难。砂眼衣原体（Chlamydiatrachomatis）一种专性寄生于细胞内的衣原体，进行体外培养的时间特别长，而且假阳性特别多，无法及时给予明确诊断朊病毒（Prion）专性活细胞寄生物，无法体外培养，传统的病原微生物培养方法根本无能为力。现代分子诊断技术现代分子诊断技术主要是指是应用免疫学和分子生物学对病原物质进行诊断检测.是多学科综合的产物,它涉及到微量化学,多种分离技术,检测系统,微电子技术,信息技术等多种技术.可应用与多个领域,包括法医鉴定、民事鉴定、各种理论或应用生物医学研究,环境检测、毒理学、生物除污、农业及畜牧业管理等。7.1酶联

3、免疫吸附检测Enzyme-linkedimmunosorbantassay(ELISA)ELISA的工作原理:抗体与抗原分子之间的特异性识别反应ELISA通常的检测过程包括以下几个步骤:将待测样品结合在固体支持物上常用的支持物市带有96孔的微量滴定板(microtiterplate);加入可以与目标分子特异反应的抗体即一抗(Primaryantibody)，反应后进行冲洗，将未结合的一抗洗去;加入二抗(Secondaryantibody)二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子。二抗上还联着一种酶，这些酶能够催化一种化学反应将无色底物转变为有色物质。一抗与二抗反

4、应完后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去加入无色底物如果样品中带有目标分子，一抗能够与之特异性结合，二抗可以与一抗结合，二抗上联带地酶就可以将无色地底物转变未有色物质可以判断出样品中带有目标分子了固体支持物一抗酶联二抗发光底物ELISA吸附试验的其他方法间接法：用于测定抗体。用抗原耦联固相载体，然后加入含有特异抗体的血清，孵育一定时间后，固相载体表面的抗原和抗体形成复合物。洗涤去其他成分，再加上酶标记的抗球蛋白结合物，加入底物，在酶的作用下产生有色物质。夹心法：用于测定大分子抗原。将纯化的特异性抗体耦联于固体载体，加入含待测抗原的溶液孵育后，洗涤除去多余的抗原，再

5、加入酶标记的特异性抗体，使之与固相载体表面的抗原结合，再洗涤除去多余的酶抗体结合物，最后加入酶的底物。竞争法：用于测定小分子的抗原和抗体将特异性的抗体耦联固体载体，加入待测抗原的溶液和一定量酶标记抗原共同孵育，对照仅加酶标抗原，洗涤后加入酶底物。被结合的酶标记抗原的量由酶催化底物反应产生的有色物质的量来确定。ELISA抗体由于技术限制，ELISA所用的抗体并不能都专一地结合待测抗原。因此，ELISA检测方法具有一定的局限性。可能出现错诊或误诊的情况。很多病原菌，尤其是对于病毒类的感染，仅凭ELISA难以得出确定的结论。要对某一目标分子进行诊断检查，最好采用单克隆抗

6、体。当病原分子与非病原分子之间只差一个抗原决定簇时，如果采用多克隆抗体，那么在ELISA中都会发生颜色变化，导致无法区分病原物质。表7-27.2DNA诊断系统原理：任何一个决定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以用作专一性的诊断标志。方法：核酸杂交、PCR检测Southern-blotting7.1核酸杂交核酸杂交的检测过程主要步骤：将单链目的DNA结合于膜上（硝酸纤维素膜或者尼龙膜）；加入已标记的单链探针，在一定的温度和离子强度下使探针分子与目标DNA分子碱基配对；冲洗。洗去未结合的标记探针DNA；检测探针和目标DNA形成的杂合分子。核酸杂交诊断检测的关

7、键要素：探针DNA，目的DNA和信号检测杂交探针杂交探针DNA：高度特异性的DNA片段，只与特定目标DNA序列杂交。杂交探针可以用来区分两个或多个物种（种级探针），也可以用来区分某一物种内的某些特定的株系（亚种级探针），甚至可以用来区分基因间的差异。杂交探针可以是DNA，也可以是RNA，可以是克隆的完整基因，也可以是基因的一个片段。杂交探针的制备（1）通过构建基因文库制备杂交探针先提取某一病原微生物株系的染色体DNA，然后用一限制性内切酶进行酶解，将得到的酶解片段与质粒载体连接，构成质粒文库。文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原微生物和非病原性微生物的核酸D

8、NA进行杂