免疫诊断与防治课件.ppt

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1、第七章免疫诊断与防治王慧第一节免疫诊断免疫学技术是当今生命科学实验研究的重要手段之一，临床上免疫学检测技术被广泛用于与免疫相关疾病的诊断、发病机制研究、免疫状态监测及疗效评估。一、抗原与抗体的检测(一)抗原抗体反应的原理和特点1、特异性　　2、可见性　　3、可逆性(二)抗原与抗体的检测方法1、凝集反应(1)直接凝集反应不溶性颗粒Ag+Ab电解质凝集成团块（凝集原）凝集素）(2)间接凝集反应2、沉淀反应(1)单向琼脂扩散　　(2)双向琼脂扩散(3)免疫电泳　　　　(4)免疫比浊单向免疫扩散半固体凝胶（掺入Ab）孔中加

2、入Ag抗原扩散到孔外，与凝胶中抗体相互作用，起初形成可溶性复合物，当抗原扩散达到与抗体等量时，产生晶格和沉淀。沉淀环直径与抗原浓度相关，可用标准曲线定量抗原。在此基础上，引入电场使Ag由负极向正极扩散，形成锥形沉淀峰，即为火箭电泳。双向免疫扩散在双扩基础上加电泳，Ag孔置负极端，Ab孔置正极端，Ag带负电荷多于Ab，向正极泳动，Ab由正极向负极泳动，形成对流，比例适宜处形成沉淀线，为对流电泳。免疫标记技术1.免疫荧光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫测定（enzymeimmunoassay，

3、EIA）3.放射免疫测定法（radioimmunoassay，RIA）4.化学发光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）5免疫印迹法（immunoblotting,Westernblot)(1)免疫荧光法：①直接法　　②间接法抗核抗体(FITC-IgG）)抗原抗体反应特异性酶催化反应高效性(2)酶免疫测定①酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)②免疫组织化学技术(immunohistochemistrytechnique

4、)定性、定量和定位AgELISA双抗体夹心法(测Ag)间接法(测Ab)加Ab,清洗加Ag形成复合物，洗涤加该Ag的另一Ab（酶标），洗涤加底物，读数加Ag，清洗加Ab形成复合物，洗涤加酶标二抗加底物，读数聚苯乙烯微量反应板免疫印迹法二、免疫细胞及其功能检测(一)免疫细胞的类型与数量检测1、E花结试验　　　　2、尼龙棉分离法3、免疫磁珠分离法　　4、流式细胞术(二)免疫细胞功能测定1、T细胞功能测定(1)T细胞增殖试验　　(2)细胞毒试验　　(3)皮肤试验2、B细胞功能测定(1)B细胞增殖试验　　(2)抗体形成细胞测

5、定3、细胞因子检测外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。外周血单个核细胞的分离分离液1.070g/l1.077±0.002g/l1.092g/l血液中PBMC的密度与其他成分不同：血小板的密度为1.030～1.035，粒细胞为1.092，红细胞为1.093，淋巴细胞和单核细胞的密度为1.075～1.090。利用一种密度介于1.075～1.092之

6、间、近于等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相应密度分布，从而被分离。常用的分层液有聚蔗糖-泛影葡胺分层液法和Ficol分层液法两种。单核细胞的获得1．粘附法单核细胞和粒细胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性，通过PBMC与玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的粘附细胞即为淋巴细胞。2．羰基铁粉吞噬法单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大，再经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。也可在单核细胞悬液内加入羰基铁粉颗粒，待单核细胞充分吞噬羰

7、基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞是复杂的不均一的细胞群体，它包括了许多形态相似而表面标志和功能各异的细胞群和亚群。根据细胞的表面标志和功能等不同，借助多种方法分离淋巴细胞亚群。E花结实验T细胞表面CD2分子+绵羊血红细胞→玫瑰花结尼龙棉柱分离法将淋巴细胞悬液加入尼龙棉柱内，B细胞易粘附于尼龙棉纤维(聚酰胺纤维)表面，而T细胞则不易粘附，由此可将T细胞与B细胞分离。该法简便易行，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，所获T细胞纯度可达90%以上，B细胞纯度可达80%

8、。免疫磁珠分离法包括直接法和间接法。直接法是将特异性抗体与磁性微粒(平均直径小于1.5μm)交联，形成免疫磁珠(IMB)。IMB与表达相应膜抗原的细胞结合，用强磁场分离磁珠结合细胞与磁珠非结合细胞，从而对特定细胞进行阳性或阴性分选。间接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗体(第二抗体)包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体(第一抗体)的细胞发生反应，从而对细胞