动物细胞培养技术课件.ppt

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1、第十二章　动物细胞培养技术动物细胞与组织培养：指的是从动物组织或细胞从体内取出，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞培养：培养物是单个细胞和细胞群。第一节体外培养动物细胞的生物学特性一、体外培养物的细胞生物学特点（一）动物细胞特点①动物细胞大，无细胞壁②动物细胞生长缓慢，倍增时间长，易受污染③需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感④动物细胞间主要以聚集体形式存在⑤原代细胞一般繁殖50代即退化死亡培养细胞最多见的表现是：①失去原有组织结构和细胞形态；②分化减

2、弱或不显、出现类似“反祖”现象；③表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。（二）体内外细胞的差异二、体外培养细胞的形态（一）体外培养细胞的分类体外细胞生长贴附型悬浮型多形型细胞（神经元和神经胶质细胞，呈多角形）上皮细胞型（上皮、肝、胰和肺泡上皮等，源于外胚层和内胚层细胞）成纤维细胞型（心肌、平滑肌、血管内皮等，源于中胚层细胞）游走细胞型（单核细胞、巨噬细胞和某些肿瘤细胞，形状不定）（生长时不贴壁，如淋巴细胞、白细胞和某些肿瘤细胞）（二）培养细胞的生长特点体外细胞生长特点贴壁接触抑制密度抑

3、制1）细胞贴壁过程2）接触抑制定义：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。3）密度抑制细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，数量仍在增多，但当细胞密度进一步增大时，培养液中营养成分的减少，细胞营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。三、培养细胞的增殖能力（一）培养细胞生命期细胞周期可分为G1期、S期、G2期和M期。培养细胞单个细胞的生长过程与体内细胞单个细胞的生长过程相似。体外培养细胞的生长增殖过程原代培养期:从体内取

4、出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。传代期：原代培养的细胞一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。1.原代培养（PrimaryCulture）期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。由于原代培养细

5、胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。2．传代期初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。3．衰退期：此期细胞仍然生存，增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久

6、性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。核型大多变成异倍体。（二）每代细胞的生长过程细胞培养过程中一代指的是从细胞接种到分离再培养的一段时间。在细胞一代中细胞倍增3～6次。时期：潜伏期；对数生长期；稳定（停滞）期；衰亡期。每代细胞生长曲线每代细胞生长过程潜伏期指数生长期停滞期细胞接种后，先进入生长缓慢的滞留阶段，胞体均呈圆球形悬浮于培养液中，接着细胞开始附着于支持物表面。细胞贴壁后，逐渐伸展，恢复细胞原有形态，经过一个潜伏期，才进入生长和增殖期。又称对数期。此期为细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂

7、相增多，成倍增长，活力最佳。又称平台期，此时细胞数量饱和，细胞不再增殖，但仍有代谢活动。细胞培养的一般过程：取材、培养及细胞冻存与复苏。第二节　动物细胞体外培养技术一、细胞的基本培养技术（一）原代培养原代培养是将动物的各种组织从机体取出，经酶(常用胰蛋白酶)或机械方法处理，分散成单细胞，置培养基中培养，使细胞生存、生长和繁殖。鼠胚组织取材1.原代细胞的取材鼠肾（或肺）取材组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分

8、层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。1）悬浮细胞的分离方法2.原代细胞的分离消化分离法2）实体组织材料的分离方法机械分散法（物理裂解）方法特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。机械分散法胰蛋白酶分散原理：主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。酶消化分离法胰蛋白酶胶原酶胰蛋白酶消化分离法1）组织块培养法