DNA重组技术的基本工具(上课用).ppt

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1、专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具基本工具：限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”①来源：主要从原核生物中分离纯化出来。②种类：已从近300种微生物中分离出4000种限制酶。③作用：1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键：具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，④作用特点：大多数限制酶

2、的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成⑤限制酶的识别序列：EcoRI限制酶的切割：中轴线黏性末端黏性末端在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。CCCGGGGGGCCC中轴线SmaI限制酶的切割：CCCGGGGGGCCC平末端平末端只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。产生黏性末端或平末端。⑥限制酶的作用结果

3、：你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原微生物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?（二）“

4、分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：⑴E·coliDNA连接酶⑵T4DNA连接酶2、作用：可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低相同点：形成磷酸二酯键不同点：1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2）DNA聚合酶需要以一条DNA链为模板；而DNA连

5、接酶不需要模板。不是一回事。③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别将外源基因送入受体细胞。(三)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”①载体的作用：质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒等②载体的种类：③作为载体的必要条件：有切割位点——供外源DNA片段(基因)插入。能自我复制——有遗传标记基因——供重组DNA的鉴定和选择。载体DNA必需是安全的——不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞

6、中去。载体DNA分子大小应适合——以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。质粒：裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒：能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。1）不属于质粒被选为基因载体的理由是（）A、能复制B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习2）有关基因工程的叙述中，正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的载体C、载体必须具备的

7、条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与目的基因连接D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键C3.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D４、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是G—A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C５.（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在

8、细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体答案：BD思考与探究P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA