行业标准：DB37T 3894-2020 大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程.pdf

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1、ICS65.020B01DB37山东省地方标准DB37/T3894—2020大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程DetectionandidentificationofturnipmosaicvirusandcucumbermosaicvirusinChinesecabbage2020-03-31发布2020-05-01实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3894—2020前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业

2、科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：吴斌、辛相启、王升吉、姜珊珊、张眉、辛志梅。IDB37/T3894—2020大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技术规程1范围本标准规定了大白菜中芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的间接ELISA、Dot-ELISA和普通RT-PCR检测方法。本标准适用于山东省芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒在传播介体蚜虫和大白菜中的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-20

3、08分析实验室用水规格和试验方法3样品采集与保存3.1蚜虫样品采集在蚜虫盛发初期进行蚜虫样品采集，于白菜田、周边蔬菜田或田间杂草丛等蚜虫喜好栖息环境，采用直径33cm的35目纱网在田间随机进行扫扑，分拣装入试剂瓶中，100%乙醇浸泡，-20℃以下冰箱保存备用。3.2叶片样品采集采集表现TuMV和CMV花叶、皱缩、植株矮化、畸形等典型症状的大白菜叶片5g～10g，单株样品袋存放。样品采集后，在冷藏条件下（2°C～8°C）运送至实验室。如果样品在2天内检测，可暂时储存于2°C～8°C冷藏箱；如果样品在2天以后检测，保存至-80℃超低温冰箱备用，

4、样品避免反复冻融。4主要仪器设备、用具和试剂4.1仪器设备仪器设备主要有：a)酶标仪；b)洗板机；c)电子天平（感量0.001g）；d)PCR仪；e)电泳仪；f)水平电泳槽；g)凝胶成像仪；h)高速冷冻离心机；i)水浴锅；1DB37/T3894—2020j)样品冷藏柜；k)低温冰箱（-20°C）；l)超低温冰箱（-80°C）；m)磁力搅拌器；n)高压灭菌锅；o)可调微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）。4.2用具用具主要有：a)无RNase吸头（10μL、100μL、200μL、1000μL）；b)酶标板；c)硝酸纤

5、维素膜（NC膜）；d)无RNase离心管；e)PCR反应管；f)研钵；g)样品袋；h)标签；i)镊子。4.3主要试剂TuMV抗体、CMV抗体、酶标二抗、TuMV特异性引物、CMV特异性引物、Trizol、液氮、三氯甲烷、异丙醇、乙醇、M-MLVRT反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记、Gelred、琼脂糖等。除特殊说明外，所有实验用试剂级别均为分析纯级。试验用水为无菌超纯水或去离子水，均符合GB/T6682-2008。血清学和分子生物学检测试剂配制见附录A。5检测5.1方法提要芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的血清学特性与

6、分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依据。两种病毒都具有很强的免疫原性，同时都是RNA病毒，因此可利用间接ELISA、Dot-ELISA和RT-PCR方法确定样品中是否带有上述两种病毒。5.2间接酶联免疫吸附测定5.2.1样品制备将单头蚜虫置于小型离心管内，加300μL包被缓冲液研碎，4°C冰箱放置12h～16h；称取待测植株样品0.1g以上，按1：10（质量：体积）加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，4°C冰箱放置4h～5h。将两类研磨液8000r/min离心3min，上清液即为制备好的检测样品。设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品为试验室保存

7、的未感染病毒的健康大白菜叶片，阳性样品为试验室保存的感染TuMV或CMV的标准样品，阴性样品及阳性样品皆通过RT-PCR检测及测序验证。阴性对照、阳性对照作相同的处理，样品提取缓冲液作空白对照。5.2.2加样2DB37/T3894—2020在酶标板上加入制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，每个样品平行加到两个孔中，每孔加样100μL，加盖，4°C冰箱孵育12h～16h。5.2.3洗板孵育结束后，用PBST清洗酶标板3次～5次。每孔每次加PBST洗液700μL，每次停留1min～2min。5.2.4加抗血清用抗体稀释缓冲液按照相

8、应病毒抗血清的使用浓度进行稀释，每孔加入稀释好的抗体液100μL，加盖，37°C孵育1.5h。5.2.5洗板同5.2.3。5.2.6加酶标抗体用抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作