激光共聚焦(简化版)课件.ppt

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1、激光扫描共聚焦显微镜原理及应用来滨复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室显微镜＋各种染色标记技术荧光标记技术优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵敏度高1000倍。2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观察多种物质的共定位。3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态变化荧光显微镜激光共聚扫描焦显微镜双光子激光扫描显微镜荧光发生的原理荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线—荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION)：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/

2、吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)488nm520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION):发射光谱；发射波峰(最大发射波长)荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。伊文斯蓝、硼化氢钠处理漂白(BLEACH)：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失—漂白。二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490长、短通滤色镜组合（LP+KP）：LP

3、450+KP490双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光488nm520nmFITC450nm490nm普通荧光显微镜是广视场显微镜普通荧光显微镜是广视场显微镜荧光相互干扰－－图象清晰度降低激发的特异性差－－背景荧光高蓝光(激发滤色片420-485nm)绿光(激发滤色片460-550nm)紫外光(激发滤色片330-400nm)高压汞灯：什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显微镜（ConfocalLaserScanningFluorescenceMicros

4、cope；LSFM）以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统共聚焦系统细胞CT共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制装置Computer计算机Confocalscananddetectorunit共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibrationtable防震台LeicaTCSSP-2MPAOBSConfocalSystem不同波长的激光光源如：340nm、488nm、543nm等点照明共轭聚焦扫描装置数字化图像合成激光扫描

5、共聚焦显微镜与普通荧光显微镜的主要区别光电倍增管检测针孔光源针孔光源分色镜物镜样本聚集平面激光扫描共聚焦显微镜光学原理荧光显微镜confocal检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点(共轭聚焦)，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔高分辨率的光学切片激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片实现三维重建激光扫描共聚焦显微镜应用领域只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类……分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移

6、大分子构象的改变、受体与配体相互作用……活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通……直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白基本应用定位、定量三维重组动态测量活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量蛋白质的转位活细胞内H+浓度（pH值）的测量线粒体膜电位的测量4.荧光漂白恢复（FRAP）技术6.荧光能量共振转移（FRET）技术1.定位荧光串色根据荧光染料的性质可将荧光串色分为二类：第一类串色是：两个荧光染料的

7、激发光谱没有重迭，但发射光谱有重叠。因为两种荧光染料的激发光谱不重迭，所以可以使用序列扫描的方法来排除串色的影响：即先使用第一种荧光染料的激发光扫描一张图像，再使用第二种荧光染料的激发光扫描第二张图像。第二种串色是：两个荧光染料的发射光谱和吸收光谱都有重迭。使用光谱扫描的方法可以排除这类串色的影响。在后面会详细介绍光谱扫描方法。荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光