琼脂糖电泳步骤.doc

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1、n带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法n泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率n影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度nDNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶n琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度nDNA分子在

2、琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应n在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动n在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型n琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子n可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系nEB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外

3、光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng的DNAn注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套琼脂糖核酸电泳的步骤1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；常见的有如下表的琼脂糖浓度（质量体积比1.0%即每100ml0.5XTBE中加入1g琼脂糖）3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入EB(5μl/100ml)，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4

4、.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。一般150V电压，电泳约15min即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。琼脂糖凝胶浓度与线

5、形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000