生物制品生产中内毒素的控制及去除.pdf

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1、生物制品生产中内毒素的控制及去除姚伟任雅平李玉中国生物技术集团公司兰州生物制品研究所，兰州，730046【摘要】细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，是革兰氏阴性杆菌生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质。人体对细菌内毒素极为敏感，极微量内毒素就能引起体温上升。热原通常是指细菌内毒素的脂多糖。不存在细菌内毒素意味着不存在热原。内毒素对热的耐受性非常强。常用的湿热灭菌法(121℃1h)不能破坏内毒素。破坏内毒素生物活性的最有效方法是干热灭菌法。一般180。C4h或2

2、50℃2h干烤，或用强碱强酸才能彻底破坏它。生物制品生产中的每一个环节都有可能污染内毒素使制品不合格，不仅给生产企业造成很大的经济损失，也会直接影响该企业的信誉和形象。随着国家药监部门对生物制品质量的要求不断提高，对内毒素的要求也越来越高。因而，从事生物制品生产的人员必须了解幽家对各项生物制品的内毒素控制要求，采取有效措施，控制制品内毒素含量，保证接种者安全。生物制品中内毒素的来源主要有：菌毒种、生产环境、不规范操作、设备及器械、原辅材料等。对于生物制品生产中内毒素污染的控制最主要的措施是生产过程控制，

3、即严格按GMP要求进行生产，严格无菌操作，防止内毒素产生。生产车间必须是符合GMP要求的洁净厂房，严格按规定进行清洁消毒，并定期对洁净问进行沉降菌、擦拭菌和尘埃粒数检测，合格后方可使用。细菌内毒素很容易吸附在容器上，生产中任何直接接触制品的设备、容器、生产用具、管路、包括检测取样吸管、试管等必须保证无热原。耐热器具如玻璃、不锈钢等应进行干热灭菌，180。C4h或250％2h干烤除去热原。不耐高温用具，如胶塞、胶管等，可采用0．2M氢氧化钠或盐酸浸泡4h以上，然后用新鲜注射用水冲洗至中性，再高压灭菌。保证

4、注射用水新鲜无热原。化学原材料应尽量选购无热原的，常用的化剂可干热灭菌。操作者必须严格按SOP更衣、洗手、消毒。对于任何非封闭系统的操作，均应采取无菌操作方式。细菌内毒素的去除可采用疏水层析、离子交换层析、亲合层析、凝胶层析、超滤、活性炭等方法。内毒素对生物制品的危害虽然很严重，但只要我们了解了内毒素的特性就可以采取适合自己的有效方法加以控制和去除。一、内毒素特性及其对生物制品的危害细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，是革兰氏阴性杆菌生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂

5、多糖类物质。人体对细菌内毒素极为敏感。极微量(1—5纳克／公斤体重)内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4小时后逐渐消退。内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等，使之产生细胞因子，作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热。严重者可发生内毒素血症和内毒素休克。热原通常是指细菌内毒素的脂多糖。严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性。不存在细菌内毒素意味着不存在热原。内毒素对热的耐受性非常强。常用的湿热灭菌法(121℃lh)不能破坏内毒素

6、。破坏内毒素生物活性的最有效方法是干热灭菌法。一般180℃4h或250℃2h干烤，或用强碱强酸才能彻底破坏它。内毒素带有负电荷，常以聚合物的状态存在而难溶于水，分子量几十万至上百万·30·道尔顿。Ca2+、M簖+可以增强内毒素的稳定性。生物制品生产中的每一个环节都有可能污染内毒素使制品不合格，不仅给生产企业造成很大的经济损失，也会直接影响该企业的信誉和形象。因而可以说，能否将生物制品的内毒素控制在国家标准要求的范围之内，反映了一个企业的技术实力和对社会负责的态度。二、国家对生物制品中内毒素的控制要求《中

7、国药典(2005年版)三部》中收录的大部分病毒类疫苗，如乙脑灭活疫苗、狂犬病疫苗、出血热疫苗等内毒素控制标准是不高于100EU／剂量，而重组类制品如酵母乙肝疫苗、CHO乙肝疫苗、干扰素a2a、a2b等内毒素要求是低于10EU／剂量。随着国家药监部门对生物制品质量的要求不断提高，对内毒素的要求也越来越高。如对流感疫苗的内毒素控制标准从100EU／剂量提高到50EU／剂量。另外，对一些活疫苗，如乙脑减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗等也提出了内毒素的控制要求。因而，从事生物制品生产的人员必须了解国家对各项生物制品的

8、内毒素控制要求，采取有效措施，控制制品内毒素含量，保证接种者安全。三、生物制品中内毒素的来源1．菌毒种：细菌类制品或以某些细菌如大肠杆菌作为表达系统的重组制品，因其大多为胞内表达，在破碎菌体时其细胞内的脂多糖被释放出来。但CHO细胞在建立种子细胞库时已进行了内毒素检测，证明无内毒素污染。2．生产环境：GMP要求生物制品生产须在符合其要求的洁净厂房内生产，如细胞培养和半成品配制及分装应在100级洁净区进行，纯化应在十万级洁净区进行。如达不到以