现代生物技术复习资料.doc

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1、现代生物技术复习资料PCR技术PCR聚合酶链式反应（英文全称：PolymeraseChainReaction），简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又

2、称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。PCR反应体系Buffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶H2O去离子水总体积20-100ml循环参数1变性使双链DNA解链为单链94oC20-30秒2退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。因此，退火温度要合适。3延伸70-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定4循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错

3、误掺入率增加经典循环参数94℃5min94℃30s55℃45s72℃1min72℃7min4℃forever引物设计：（1）序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%，尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列。（4）引物不应当设计在靶DNA的二级结构区域，引物内部也要避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。（7）人工合成引物最好通过PAGE或HPLC纯化。常用PCR技术一，目的

4、DNA片段的克隆；二，反转录PCR得到cDNA;三，菌落和菌液PCR；四，半定量RT-PCR;五，荧光实时定量qRT-PCR;六，Tail-PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR);七，引入定点突变PCR.DNA重组技术(基因克隆，分子克隆)步骤：1，提取目的基因，酶解连接到克隆载体；2，将重组DNA分子转入受体细胞中复制保存；3，筛选和鉴定转入了重组DNA的受体细胞；4，检测含重组DNA的受体细胞中外援基因的表达。限制性内切酶:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。

5、Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。最早发现的Ⅱ型限制性内切酶EcoR1。大多数Ⅱ型限制性内切酶的识别序列是回文序列。限制性内切酶的命名第一个字母为含有此酶的细菌属名的第一个字母；后两个字母为种名的前两个字母，小写；然后是株系，用大写字母，通常省略；罗马数字表示从同一细菌中分离的不同的限制性内切酶。EcoRⅠEcoRⅤBamHⅠXbaⅠBglⅡDNA连接酶大多数连接酶都是从T4噬菌体中分离出来的；催化在两条DNA链的末端形

6、成磷酸二酯键。克隆载体可携带插入的目的DNA进入宿主细胞内并能自我复制的DNA分子。此种DNA分子含有能在宿主中复制的位点和便于筛选的遗传标志。通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片

7、段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。质粒能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。F质粒：携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。R质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒质

8、粒大小：小的不到1KB，大的超过500KB。质粒的分类高拷贝数质粒：在每个宿主细胞中达10到100个拷贝；低拷贝数质粒：在每个宿主细胞中只有1到4个拷贝。窄宿主范围质粒：复制起始点较特殊，只能在一种特定的宿主细胞中复制。广宿主范围质粒：复制起始点不太特异，可以在多种细菌细胞中复制。质粒的特性1，不能太大，一般小于15KB；2，有用来克隆外来DNA的单一的限制性内切酶识别位点；3，应该有一个或多个选择标记。质粒要经过遗传改造才能