动物细胞大规模培养技术.ppt

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1、动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中空纤维法等。如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的工具。1悬浮培养技术基本操作(1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。传代时按比例稀释即可继续培养。对贴壁性

2、细胞，最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。但产率低，劳动强度大，占空间大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程度上改变了以上这些不足。微载体是直径60—250um的微珠。2微载体培养技术理想的细胞支持物应该具备特征：(1)生物相容性．(2)简便的无毒害固定化过程。(3)良好的传质特性。(4)良好的机械稳定性。(5)最大的比表面积。(6)适合细胞生长的形状和大小。(7)粒径分布均一。(8)能高压灭菌。(9)可重复利用，易于清洗。(10)能保护细胞免受机械损伤。(11)接种方便。(12)

3、能固定大部分细胞。(13)适合大规模培养。(14)易使细胞、载体与培养基分离。(15)适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。微载体系统培养细胞的步骤是：(1)选择合适的微载体类型(2)浸泡水化及消毒(3)接种(4)培养观察与细胞记数(5)消化(通常用酶消化法)。采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果较好。(6)分离细胞：对于回收率要求不高的细胞种类，分组沉降简单易行。脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速微载体沉淀。(7)传代培养：如果进行放大培养，可在

4、细胞脱离微载体后，加入一些新的微载体以增大培养体积，提高培养液的利用率，不过此法比全部用新微载体的细胞得率要少。尽量减少培养液中Ca2+浓度可促进微载体之间的细胞转移。除了交联葡聚糖为基质的微载体,还可采用以下微载体：1)纤维素为基质微载体：2)蛋白质为基质微载体：变性胶原微载体，蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合。3)高分子材料为基质微载体：4)无机玻璃基质微载体。3多孔载体培养一优点降低血清用量，增加细胞固定性。大的生长空间，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化连续灌流培养。多孔载体固定细胞过程简单，对

5、细胞无毒害和损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养简单，特别适合于反应器大规模培养。多孔载体制备的材料选择主要考虑材料的生物相容性、机械稳定性和热稳(1）生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁细胞有良好的黏附作用。(2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用的要求。(3)热稳定性：在121℃、蒸汽灭菌下不分解、不破碎、不软化。4微囊化培养技术微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质可包裹在其中不能逸出，利用它们

6、催化反应底物。微囊化培养是借鉴固定化技术将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培养。细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护，细胞总的生长体积有了一定的增加，而且减少了搅拌对细胞产生的剪切力。微囊化培养为单克隆抗体、干扰素等生产提供了有效途径。5中空纤维法中空纤维细胞培养技术是理查德·克瑞克等在1972年发明的。最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也可在上面帖附生长。中空纤维细胞培养技术就是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管”——中空纤维供给细胞生长的营养等

7、条件。培养系统的核心部分由3-6层这样的空心纤维组成，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔。培养一段时间后，逐渐用无血培养基代替含血培养基。此时虽然细胞不再增殖，但能正常生活并分泌所需的代谢产物。由手这种培养方法在分离和纯化分泌物时比较方便，因而在生产激素和单抗时经常采用。九动物细胞生物反应器培养9．1生物反应器的特点分析由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和过程控制提出了特殊的要求。细胞培养用生物反应器的种类越来越多，规模也越