植病研究法---细菌病害的研究法.ppt

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1、第三部分植物细菌病害研究技术第一节植物病原细菌的鉴定第二节病原细菌的分离培养第三节病原细菌培养性状观察第四节致病性测定第五节细菌的形态观察第一节植物病原细菌的鉴定1．细菌病害标本的检查(1)症状的观察植物细菌病害表现各种类型的症状，不同属的细菌侵染植物后引起的症状有所不同。棒形杆菌属细菌主要引起萎蔫，假单胞菌属细菌主要引起叶斑和叶枯（少数枝枯、蔫萎和软腐），黄单胞菌属细菌主要引起叶斑和叶枯，土壤杆菌属细菌主要引起瘤肿（少数其他畸形），欧文氏菌属细菌主要引起软腐（少数蔫萎和枝枯）。这样的区分虽然不是绝对的，但是指出它们之

2、间的关系，在诊断上是很有意义的。许多细菌性病害的病斑带有水渍状，有时可以作为诊断的特征，但并不是所有细菌病害都是这样。病部有时有菌脓排出。菌脓灰白色到黄色，珠状或其他形状，干燥后在表面形成菌膜。第二节病原细菌的分离培养植物病原细菌一般都是用稀释分离法。病原细菌在组织中的数量很大，稀释培养可以使病原细菌与杂菌分开，形成分散的菌落，容易分离得到纯培养。组织分离法对病原细菌是不适用的，原因是它不能使病原细菌与杂菌分开，杂菌生长快，会抑制病原细菌的生长。稀释分离有以下两种方法。1.培养皿稀释分离法取灭菌的培养皿3个，每个培养皿

3、中加灭菌水0.5ml，切取约4mm见方的小块病组织，经过表面消毒和灭菌水洗过3次以后，移在第一个培养皿的水滴中。用灭菌的玻棒将病组织研碎，静置10～15min，使组织中的细菌流入水中(配成悬浮液)，然后用灭菌的移植环从第一个培养皿中移植3环到第二个培养皿中，充分混合后再移植3环到第三个培养皿中。然后，将溶化的琼胶培养基冷却到45℃左右，倒在三个培养皿中。冷却凝固后，将培养皿翻转，在适温下培养。培养皿用记号笔注明分离材料、日期和稀释编号。细菌悬浮液的配法有时影响分离的效果。一般植物病原细菌，用灭菌水稀释是适宜的。有时改用

4、灭菌的生理食盐水(0.85%的NaCl)或肉汁冻培养液稀释比较好。如水稻白叶枯病细菌，用蛋白胨水或粘土悬浮液稀释的，培养后形成菌落的数目比用清水稀释的多。粘土的作用大致是细菌团聚在土粒上，更容易形成菌落。2.平板划线分离法取小块病组织，经过表面消毒和灭菌水洗过2次以后，放在灭菌载玻片上的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎。静置一定时间，用灭菌的移植环蘸取以上组织液在琼胶平板上划线培养;先在平板的一侧顺序划3～5条线，再将培养皿转60°将移植环灭菌后,从第二条线末端，顺序划出3-5条线。目的都是使细菌分开形成分散的菌落。划线分离法

5、的关键是要等到琼胶平板表面的冷凝水完全消失后才能划线，否则细菌将在冷凝水中流动而影响形成单个分散的菌落。为了加快消除冷凝水，可以将培养皿在37℃的温箱中放一二天，或者在无菌的条件下，将培养皿的盖打开，翻转培养皿斜靠在盖上，在50℃的干燥箱中干燥30min。植物病原细菌的分离还需注意：[1]分离材料新鲜要从新鲜的标本和新的病斑分离。存放太久的标本，其中病原细菌的生活力减弱，而腐生性细菌则滋长很快，从这种组织分离到的大都是腐生菌。分离用的标本最好是夹在吸水纸中邮寄，放在塑料袋中保湿是不适宜的。标本保存的时间较长而不容易直接

6、分离成功，可以经过接种后再分离.例如，分离软腐病细菌时，由于腐烂组织中往往杂有大量的腐生菌，可以挑取少许腐烂组织针刺接种在相应的健全组织上，发病以后再从接种的组织上分离。[2]适宜的培养基分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。一般来说，寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。同时，一种适宜于纯培养的培养基(细菌群集没有其他杂菌干扰)，不一定适宜于分离(细菌分散而单独存在，同时还可能有杂菌干扰)。因此，分离时要选用适当的培养基，有时要用选择性培养基。但有时失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当

7、或存放的时间太长。因此，在灭菌后和使用前，最好是再核对一下培养基的酸度。二、分离培养基（1）通用培养基:NA培养基（2）属和种的选择性培养基[1]土壤杆菌属(Agrobacterium)一般是用甘露糖醇培养基甘露糖醇15g硝酸钠(NaNO3)5g硝酸钙[Ca(NO3)z·4Hz0320mg磷酸氢二钾(K2HPO4)2g氯化锂(LiCl)6g硫酸镁(MgSO4·7H20)0.2g溴百里酚蓝0.1g琼胶15g蒸馏水1000ml灭菌后酸度是pH7.2，培养基呈深蓝色。土壤杆菌属细菌的菌落圆形、凸起、发亮，最初浅蓝色，以后深绿

8、色。溴百里酚蓝抑制革兰氏反应阳性的细菌，氯化锂抑制假单胞菌属细菌。以上培养基，已有选择性培养基的作用，以甘露糖醇作为碳源是它的特点。[2]假单胞菌属(Pseudomonas)没有特殊的营养要求，许多培养基都可用于分离。常用的培养基有：①甘油酪朊水解物培养基甘油10ml蔗糖10g酪朊水解物1g氯化铵(NH4c1)5g磷酸氢二钠(Na