用纯化的INH抗体包被微孔板,制成固相载体,往微孔中依.doc

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1、用纯化的INH抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的INH抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的INH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1、 酶标板：一块（96孔）2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为4,000pg/ml，

2、然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成4,000pg/ml，2,000pg/ml，1,000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔0pg/ml。如配制2,000pg/ml标准品：取0.3ml（不要少于0.3ml）4,000pg/ml的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。1、酶标仪（建议仪器使用前提前预热）2、微量加液器及吸头，EP管3、蒸馏水或去离子水，滤纸标本的采集及保存1、血清：

3、全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于1000g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。3、其它生物标本：请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保    存，但应避免反复冻融。操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如

4、样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100，余孔分别加标准品或待测样品100，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37温育2小时。ELISA试剂盒性，每次实验请使用新的标准品溶液。2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加ELISA试剂盒100（临用前配制），酶标板加上覆膜，37温育1小时。3、弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400/

5、每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。4、每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100，加上覆膜，37温育1小时。5、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。6、每孔加底物溶液90，酶标板加上覆膜37 避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。7、每孔加终止溶液50，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物    液的加入顺序相同。8、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（值）注：5、在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体

6、沉积到管底。标准品、ELISA试剂盒工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10），以避免由于不准确稀 释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液。6、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。7、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射洗板方法1、手工洗

7、板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；根据需要，重复此过程数次。2、自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性   本试剂盒可同时检测重组或天然的人INH，且与其它相关蛋白无交叉反应。计算  各标准品及样本 值扣除空白孔值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，

8、如curveexpert1.3，根据样品值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。检测范围： 6