微孔板检测原理和应用

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1、微孔板检测原理及应用微孔板类型从6孔-48孔的细胞培养板、96孔酶标板到384、1536孔高通量筛选板2微孔板检测优势VS分光光度计通量高：多样品检测速度快、方便小体积检测，有效节省试剂检测功能模式多，如双色发光、BRET等比色杯应用范围广微孔板3微孔板检测技术光吸收技术（Absorbance）荧光技术（Fluorescence）发光技术（Luminescence）4一、光吸收（Absorbance）5分光光度检测又称分子吸收光谱检测，是利用物质分子所特有的吸收光谱而对物质进行定性定量测定的检测技术。•紫外分光光度检测（200～400nm）•可见光分光光度检测（400～760n

2、m）•红外光分光光度检测（760～1000nm）检测单位用OD值表示OD是opticaldensity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度6光吸收原理朗伯-比尔定律透光率=I/Iox100%吸光度(OD)=-lg（I/Io）=ε∙C∙b光吸收值（OD）与浓度成正比7光吸收技术的应用核酸和蛋白质定量ELISA（酶联免疫检测）细胞活性分析酶活性分析内毒素测定,IC50,ID50环境检测（农药残留、重金属污染等）细菌生长检测光谱扫描实验NADPH测定，等8光吸收应用——核酸和蛋白质定量（紫外光吸收）Absorbance260nmAbsorbance280nm9光吸收应用—

3、—ELISA免疫分析碱性磷酸酶（AP）常用底物PNPP检测波长：405nm特点：本底低，灵敏度高，较昂贵辣根过氧化物酶(HRP)底物：ABTS410/650nmOPD492nmTMB450nm特点：常用，灵敏度不如AP系统病毒性疾病、激素、内毒素、疫苗抗体、药物残留检测等10光吸收应用——细胞活性分析（MTT法）MTT被线粒体脱氢酶还原，生成深紫色产物formazan（甲腊）Absorbance570nmMTT，即噻唑蓝，黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶。for

4、mazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的溶液中溶解，用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。11光吸收应用——乙酰胆碱脂酶检测乙酰胆碱酯酶（AChE）：可作为反映胎儿神经系统成熟度的指标。方法（检测波长450nm）：乙酰胆碱脂酶乙酰胆碱胆碱＋乙酸＋巯基显色剂TNB黄色化合物12光吸收技术的优势和缺点优势操作简单，低成本缺点特异性不强灵敏度低细胞学实验中采用的底物往往有细胞毒性13二、荧光(Fluorescence)

5、14荧光原理λEx光能激发ExcitationSignalS1Sonucleous电子能级跃迁innerorbitalouterorbitalλEmEmissionSignal释放光能15荧光检测原理许多有机化合物，特别是芳香族化合物，以及生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度和样品浓度成正比。有些化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应后检测。特点高灵敏度，比光吸收检测法高3个数量级所需样品量少，适合药物和生化样品分析无毒性，可以活细胞或活体检测可以进行多重标记（如蓝色细胞核，红色线粒体等等）

6、使用方便，高效安全，无辐射16荧光标记的种类——内部基团蛋白质内的色氨酸、酪氨酸蛋白质折叠/变性研究17荧光标记的种类——外标荧光荧光染料，如与Ca2+结合的Fura-2,Indo-1等，与DNA结合的PicoGreen，PI等，与蛋白质结合的TexesRed，Rhodamines等荧光蛋白，如GFP，RFP等量子点，QuantumDot上转换荧光材料，即稀土元素等膜探针（疏水性DPH、亲水性探针与磷脂相连等）膜电位探针，如JC-118荧光标记的种类——荧光特性的转变通过酶解作用，使非荧光物质转变成荧光物质，一般用于酶活的测定，如Caspase19荧光的影响因素溶液pH值温

7、度(lowtemphighsignals...)自发荧光(microplates,serum,PhenolRed,...)淬灭光漂白20荧光的影响因素——PH值ExcitationSpectraExcitationSpectraEmissionSpectraEmissionSpectra40000400003500035000pH5.0pH5.0pH5.0pH5.0pH6.0pH6.0pH6