化学发光检测原理和微孔板

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1、化学发光检测原理概述化学发光作为一种分析工具的吸引之处就在于检测的简单性。化学发光的实质是自身发光，这意味着化学发光的分析测试仪器只需要提供一种可以检测光信号和纪录结果的方法就可以了。自发光检测仪需要一个闭光的样品室和光检测器。最简单的便是相片纸或X光片，甚至视觉检测器都可以。化学发光检测方法的简单性使得它的应用很简单并且完全可以自动化。但是它的灵敏度又是怎么样的呢？化学发光有如下两个内在的优势：1．绝大多数的样品没有“背景”信号，如它们自身不发光。2．化学发光的检测不是一个比例测试，这是与荧光和吸收或比色测试不同的。在荧光测试中，具有小的StokesS

2、hift的荧光基团非常难检测。荧光很难从激发波长中分辨出来。另外一个问题是，特别在样品是浑浊的情况下有一部分杂光会进入到检测器。在吸收光测试上，其灵敏度受到限制的根本因素是需要在两个相对较强的信号之间去区分一个较小的差别。需要注意的是检测器对光谱的敏感性近可能接近化学发光的光谱，以得到最大化的灵敏度。一般在自发光仪中的光电倍增管对蓝光有最佳的反应，对红光的末端光谱不太敏感。固态检测器对红光有较好的反应。X光片广泛用于记录在尼龙膜、纤维素膜或PVDF膜上的化学发光印迹分析。但是我们需要牢记在心的是X光片仅能够用于检测紫外到蓝光光谱范围内的光信号，虽然有一些

3、特殊的光片对增强的绿光有敏感性。液体样品的检测有一些特定的词来描绘化学发光检测：灵敏度、线性和动态范围。每一个词的意义如下：1．灵敏度指的是某种东西可靠检测的最低水平。“某种东西”是指在一个分析测试中的测试物。测试物是被标记了一种可检测的东西，如化学发光化合物或的一种酶。分析物也可以是一种通过与具有标记的亲合物有特异性结合反应而检测的物质。所谓的可靠检测指的是针对一个空白测试样品，检测器能够重复感应到最低水平的信号，而这种信号是由所检测物本身产生的。2．线性描述的是信号与分析检测物浓度范围之间的关系。理想的比例因子是常数；信号点与分析检测物是一条直线关系

4、。标准曲线可以不是直线，如s形，仍是有用的。3．动态范围指的是被检测物浓度与信号单一模式的变换范围。它定义的是分析的工作范围。你期望通过化学发光得到什么水平的灵敏度呢？答案不一定会满足你的要求，“它是有条件的”。在很少情况下，检测器的灵敏度或化学发光方法会是检测的局限因素。现在的检测器可以达到很高的灵敏度。大多数情况下，而是其它的一些因素显示了分析检测的灵敏度。最通常的是生物成分（抗体、酶等）的非特异性结合到反应容器和支持物的表面。例如，免疫分析，印迹实验，核酸杂交和其它的酶联结合实验都是受制于此因素。管和微孔板玻璃、透明或半透明的塑料管、比色皿是化学发

5、光测试比较理想的材料。理想的是光能够通过一个平面然后测试，以减少边际效应。曲面也可以使用，如圆柱型的测试管。用不同的测试管测试比较结果，这些管必须是统一生产的，才可以比较结果。微孔板——从化学发光反应中发射出的光是各向同性的，即在各个方向上同等发射出来的。如果一个化学反应是在透明的微孔板中的微孔中进行，光不仅从垂直方向发散，还从水平方向发散出来。光很容易的通过各个孔之间的间隙和孔壁。光较强的孔就会干扰相邻的孔。因此，化学发光测试一般不用透明微孔板。不透明的微孔板和板条主要有两种——白色和黑色。使用者需要注意的是黑色的因为有光吸收，所以它的信号会比白色板有

6、很明显的减弱（将近10倍）。因为所有的孔是同等比例的收到影响，所以不管他们的强度，定量并没有问题。白色或黑色板的选择，主要是基于预期检测信号的强弱，白色板用于检测较弱光的检测，黑色板用于检测强光的检测。黑色板的另一优点就是可以削弱非特异性结合所带来的问题。此外，白色板并不是完全同等不透明。为荧光设计的白板的白色素比用于化学发光的白板的要少的多。在荧光检测时，每检测一次，一般在针对一个孔，消除了相邻孔之间的干扰。白色微孔板的好坏很容易检测，只要在板的后面放上一只灯，然后看每个孔。如果穿过的灯光不仅仅是淡淡的，那么用于较强的化学发光底物的分析是会有一些问题的

7、。固相样品的检测（印迹膜）X光片——它已经被认为是对固定在膜上的蛋白或核酸进行化学发光检测的强有力的工具，如Southern、Northern和Western杂交的化学发光检测。此类商业化的产品已非常广泛。如果能够控制好非特异性的结合，灵敏度是足够的。如果不能很好控制，将会X光片上曝光过度。解决这个问题的最好策略是减少结合的试剂的量，例如抗体或类似物。曝光时间1到10分钟通常是足够显现大多数的印迹。更长的很少能提高信号/背景。关于灵敏度相对的方面来讲，未得到信号并不意味着分析物的不存在。任何一种光学用膜片都有一个强度阈值，在这个阈值之上银颗粒的光化学转化

8、才能成功。否则会失败，称之为“可逆失败”。在实际操作中，化学发光信号低于阈值强度