现代分子生物学.doc

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1、1.全自动测序仪：原理：在DNA片段中加入4种被荧光分别标记的ddNTP做为引物，ddNTP的作用是链终止剂，当进行PCR时，遇到ddNTP便会停止，因此会形成链长度不一的一系列片段，由于每个片段末端标记的荧光不同用激光探头扫描电泳后形成的按大小顺序跑出的条带，即可读出核苷酸序列。①在片段中需加入4种不同的ddNTP②加入PCR需要的模板，Tap聚合酶，缓冲液，及dNTP，进行单向PCR，产生长度不同的一系列片段。③将PCR扩增出的片段进行PAGE电泳，其电泳后只跑出一个带④用激光探头扫描条带，即可读出相应序列。2.（blue-whitescreening）蓝白斑筛

2、选：是一种可以在同一转化板上完成重组质粒的筛选方法。次方法涉及基因的插入失活，利用一种蓝色化合物的形成作为指示剂，在这种情况下失活的基因是lacZ，该基因编码β-半乳糖甘酶，受到启动子的调控，当大肠杆菌菌株表达lac阻抑物，则载体那个的lacZ基因由IPTG诱导表达，表达形成的酶可以利用底物X-gal形成蓝色化合物，重组质粒中lacZ的插入失活导致不能形成蓝色菌落而形成白色菌落。色氨酸操纵子转录的衰减作用：色氨酸与色氨酸阻抑物结合形成复合物才能结合到操纵子基因上。该阻抑物转录的起始减少了大约70杯，色氨酸操纵子的RNA序列含有4个互补区，1、2、3、4，通常情况下形

3、成1：2，3：4的互补，在色氨酸含量高时，核糖体迅速在两个色氨酸密码子处插入色氨酸，这样翻译可以直达前导肽末端，当RNA聚合酶到达终止序列时，核糖体封闭了2，3：4形成弱化发夹结构，转录终止。当色氨酸含量低时，缺乏氨酰tRNA，核糖体将在两个色氨酸密码子滞留封闭1，形成2：3抗终止子，使3：4弱化子不能形成，转鹿得以延续到其下游。3.五种重要的工具酶：①碱性磷酸酶：从DNA或RNA的5`端去除磷酸基。②DNA连接酶：5`-磷酸与3`-羟基相结合。③DNA聚合酶1：沿5`至3`的方向合成与DNA模板互补的DNA。④多核苷酸激酶：一个依赖ATP的反应，向双链或单链DNA

4、,RNA的5`-羟基末端添加磷酸基。⑤末端转移酶：可将核苷酸加到单链或双链DNA，RNA的3`端。4.质粒小量质备：仅从几毫升培养液中提取小量质粒用作分析的过程。过程:1将携带有目的质粒的大肠杆菌接种于数毫升的液体培养基中进行培养。2增值至稳定期后，离心液形成菌体沉淀3用碱裂法提取DNA（重悬—碱裂体—中和）4酚抽提除去蛋白污染物5乙醇沉淀，对DNA及RNA进行浓缩（可加入RNaseA降解RNA）6在适宜的缓冲液中进行悬浮。半不连续复制：在DNA复制中，两条新生链的合成在同一复制叉中同时进行，因DNA复制时只能以5′-3′方向进行，所以两条链中的一条链（即前导链）从

5、起始点按5′-3′方向进行连续复制，而另一条链（即随后链）从复制叉处起始按5′-3′方向反向形成冈崎片段，随着复制叉的前进，前导链被复制成连续长链，而滞后链形成不连续的冈崎片段，之后被DNA连接酶连成连续的DNA，因此称为半不连续复制。克隆技术的应用有：重组蛋白的生产，遗传修饰生物体的构建，DNA指纹分析，医学诊断及基因治疗等。DNaseI足迹法：可确定与蛋白质作用的DNA实际序列区域。将末端标记的DNA片段与蛋白质样品相混合，待相互混合后用DNaseI对复合物进行温度配对。在蛋白结合区域，核酸酶不能轻易接近DNA骨架而难以切割，再将酶解的DNA进行PAGE电泳分析

6、，在对照DNA的泳道中的梯状显示出所有随机的酶切割部位而在加入蛋白样品的泳道显示出某些带的空缺或未切割的区域，即对应于蛋白结合的DNA位点（足迹）（嵌套式）PCR：在第二次PCR中，以第一次PCR的底物作为模板，使用一套新的引物，形成更短的PCR产物。可以避免非特异性产物的产生，排除其它基因成员，保证得到较纯的目的产物。Southern印迹：用来检测琼脂糖凝胶上众多DNA分子中能与特定探针杂交的DNA分子。DNA片段经琼脂糖凝胶电泳后，通过毛吸作用转移至尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用碱变性使DNA分子转变成单链DNA，然后干燥使DNA固定在膜上，膜上DNA的位置与凝胶中

7、的完全相同，固定后用荧光标记的探针与其进行杂交，充分洗涤后，用放射自显影法检测杂交的探针，从而检测出DNA分子1.滚环的复制过程和特征：过程：在DNA复制过程中，以某种方式切断双链DNA中的一条链。其5`端与特殊的蛋白质相连，3`端由DNA聚合酶催化延伸。以未切断的一跳球形链为模板加上新的核苷酸，由于3`端不断延长，而5`端不断被甩出成为游离的单位，好像中间的环不断滚动一样，当游离的链达到一定程度时开始复制其互补链。特征：①链的延伸不需要引物。②模板是环状的③单向复制，形成多拷贝的串联复合物，③由酶从中切开，重新成环。2.双抗筛选：载体含有氨苄青霉素抗性基因和四