端粒长度检测方法.doc

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1、端粒长度检测方法：实时荧光定量PCR分两部分进行，分别测定端粒和内参基因RPLPO（核糖体大亚基PO蛋白基因）的Ct值，每次反应需要设定标准曲线。端粒（T）重复拷贝数与单拷贝基因（S）的比率，即T/S比率可以得出端粒的相对长度，而T/S比率与端粒长度成正比关系。T/S计算公式如下：T/S=[2CT(telomeres)/2CT(singlecopygene)]=2-ΔCT1基因组DNA的提取1.提取人外周血基因组DNA以试剂盒提取获得人外周血基因组DNA。2实时荧光定量PCR测定DNA端粒长度1.引物序列端粒Tel1：浓度675nmol

2、/L序列5’-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’端粒Tel2：浓度1350nmol/L序列5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’RPLPO基因hRPLPO1：浓度800nmol/L序列5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’RPLPO基因hRPLPO2：浓度800nmol/L序列5’-CAGCAAGTGG-GAAGGTGTAATCC-3’2.标准曲线制作选取同一血样基因组DNA为标准品，使用等比稀释，稀释系数为2，浓度

3、范围为：0.25-64ng/μl，即可稀释得9个浓度梯度，分别为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25ng/μl，制作的标准曲线R2>0.98。1.反应体系（每个样设置品三个重复）10μl反应体系gDNA10ngMasterMix(quantiTectSyberGreenPCRkit)Upto10μl注：内参及样品反应体系中，MasterMix除了引物不同外，其余成分均相同另一文献所述的反应体系25μl反应体系SYBRPremixExTaq(2X)12.5μlgDNA1.0μl(约60ng/μl)端粒Tel1(内参基因hRP

4、LPO1)0.625μl（1μl）端粒Tel2（内参基因hRPLPO2）2.25μl（1μl）dH2OUpto25μl4.PCR反应条件95℃10min95℃15sec54℃2min54℃检测荧光强度，35个循环72℃10min参考文献：[1]SoniaGarcı´a-Calzo´n，AdrianaMoleres，Ascensio´nMarcosetal.TelomereLengthasaBiomarkerforAdiposityChangesafteraMultidisciplinaryInterventioninOverweight

5、/ObeseAdolescents:TheEVASYONStudy[2]吕昆，林丹，许淼等.应用实时荧光定量PCR测定牛体细胞端粒长度[3]王敏敏，杨浩，刘广义等.荧光定量PCR测定端粒长度