研究性学习论文参考.doc

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1、不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻后成活率的影响XXX(姓名)摘要：木实验以处于对数生长期的小鼠胎儿成纤维细胞为材料，采用慢速冷冻、快速融解的冷冻技术,比较二甲基亚矶(DMSO)、乙二醇(EG)、甘油(GL)这三种冷冻保护剂分别与血清的不同配铉组合以及这三种保护剂Z间的不同配铉组合对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻后成活率的影响。结果发现：以10%DMS0+20%EG的冷冻保护剂冷冻效呆最好，解冻后细胞的成活率显著高于其他组合类型的冷冻保护剂。关键词：不同冷冻保护剂小鼠胎儿成纤维细胞成活率胚胎冷冻保存就是将动物的早期胚胎，采用特殊的保护剂和降温措施进行冷冻，使其在-196°C的液氮屮停

2、止代谢或者减弱到足够小的程度，但又不失去升温后恢复代谢的能力,从而能长期保存胚胎的一种生物技术。自1972年Whittingham首次报道植入冷冻小鼠胚胎获得正常后代以来，冷冻技术已经在多种细胞领域屮取得成功。近儿十年来，丙二醉、二甲基亚矶和甘油结合蔗糖已经广泛应用在哺乳动物及人类胚胎的冷冻保存屮⑴。成纤维细胞具有较强的分裂增生能力，适丿应性强且性状稳定，是研究动物克隆最常用的细胞类型。木实验通过对小鼠胎儿成纤维细胞的培养，建立小鼠胎儿成纤维细胞系，并用DMSO、EG和GL作为冷冻保护液，添加10%-30%的FCS的DMEM为基础冻存液保存成纤维细胞，筛选合适小鼠胎儿成纤维细胞冷

3、冻保存的保护液组分，为动物细胞核移植、转基因等提供核供体材料。1材料和方法1.1材料与仪器实验材料：小鼠胎儿成纤维细胞实验试剂：DMEM培养液、20%胎牛血清(FBS)、分析纯二甲基枫(DMS0)或甘油、消化液(DMEM+0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA)、培养液(DMEM+10%胎牛血清)，0.1%台盼蓝溶液,10%EG和10%GL冷冻剂实验器材：超净工作台、CO2培养箱、离心机、高压灭菌锅、电热干燥箱、倒置显微镜、低温冰箱、酒精灯、分析天平、吸管、25ml卡氏培养瓶、无菌60mm培养皿、烧杯(100ml)、眼科剪、眼科银、不锈钢筛(lOOum)s离心管(100ml)、细

4、胞冻存管、血细胞计数板。1.2实验方法与步骤1.2.1小鼠胎儿成纤维细胞的获取处死孕鼠(引颈法)，剪开腹腔，取出胎儿，去头、尾、内脏，用酶消化的方法，用DMEM+O.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液2~3ml消化3-5min并收集细胞，2500r/min离心5min弃上清液，用DMEM洗涤液清洗细胞1-2次。1.2.2细胞的稀释与分装组织块培养法和消化法接种，3天后更换培养液；再过三夭，进行细胞的传代培养，并于三天后更换培养液；再3天后，冷冻保存操作：取出传代细胞，去除培养液。1.2.3冻存将细胞冻存管用棉花包好放入泡末小盒，固定好后放入-70°C冰箱屮，冻存一个星期。1

5、.2.4解冻将冻存取出,立即投入盛有：38°C温水的烧杯中，不时摇动，使其尽快解冻。1.2.5洗涤从水浴中将冻存管取出，用乙醇消毒冻存管后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并立即加入洗涤液至10ml,混匀ri2500r7min离心5min,弃上清液,加入培养液至6ml并混匀。1.2.6接种加入适当培养液稀释并调整细胞浓度到5*10’/ml,以毎瓶3ml接种到培养瓶屮，置37°C、5%二氧化碳、饱和湿度下培养，根据细胞生长情况及时更换培养液以及传代。并在一个星期Z后镜检观察细胞生长情况1.2.8镜检计数a）取上述细胞悬液lOOuL,滴加0.1%台盼蓝染液，染色10—15mi

6、nob）用血细胞计数板计数，镜检四个大方格，记录活细胞数与细胞总数，并计算其戚率，评价冷冻效果。2.结果与分析冷冻剂血清浓度平均存活率10%DMSO10%FCS63.02%20%FCS67.27%30%FCS63.34%10%GL10%FCS36%20%FCS39.6%30%FCS42%10%EG10%FCS38.07%20%FCS40.27%30%FCS37.82%5%DMSO+5%EG10%FCS52%20%FCS48.54%30%FCS47.28%5%DMSO+5%GL10%FCS49%20%FCS33%2.1实验结果AuAuAuAu007—6-ionVAvAv+平端活率卷

7、+0s_二卷f9十0S_二卷卷+0SS卷我0:2JO一菠01+9;0一一£0一£0一80.00%70.00%60.00$50.00$40.00$30.00520.00%10.00%0.00%10%DMSO10%FCS■10%DMSO20%FCS10%DMSO30%FCS10%GL+10%FCS110%GL+20%FCS□10%GL+30%FCS■10%EG+10%FCS30%FCS51%细胞存活率二活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100%1.210%DMS0与不同的配置比