分子克隆技术(1).doc

《分子克隆技术(1).doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、分子克隆技术龟叔第一部分：填空1•质粒的三种状态：超螺旋，开环，线型2.DNA纯度：吸光值检测：检测260nin、280nm吸光值，紫外分光光度计A26a/A280=1.8-1・9；1・8最佳，低于1・8说明有蛋白质，大于1・8说明有RNAO3•分光光度计：lOD=5()ug/mlDS-DNA或l()D=40ug/mlRNAorSS-DNA4•几种工具酶:限制性内切酶，碱性磷酸酶，连接酶5.限制酶的一个活性单位(1U):原则上指在5幕1反应体系中，37C下，经过1小时的反应将1pg的DNA完全分解所需要的酶量

2、•6•引起星星活性的因素：高浓度的甘油(>5%)；•酶过量(>10()U/ug)；•低离子强度(v25mM)；•高pH(>pH8.0)；•有机溶剂(DMSO,乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；•用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)6.DNA酶切不完全的主要原因有：dna中有酶抑制剂，甲基化；操作不标准，反应条件不合适；酶活力不够。7.DNA样品中抑制酶活的污染物主要有：蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性。解决方法：纯化DNA,增加酶作用的单位数，

3、增大反应体积稀释抑制剂，延长反应时间,加入聚阳离子亚精胺。8.DNA的回收纯化:1・低熔点琼脂糖2•透析带电洗脱法3.glassmilk纯化4.柱回收试剂盒9.地高辛(DIG)是灵敏度高、非放射性核酸标记检测体系。dig检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。第二部分：简答1、SolutionK2、3的作用solutionI重悬细菌solutionIL其中的SDS［坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH使DNA变性、

4、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态2、移液器的使用注意事项a设定移液体积，装配移液枪头。b垂直吸液，慢吸慢放c吸有液体的移液枪不宜平放。d使用后调回最大量程，放回3、尼龙膜、硝酸纤维素膜的异同点尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，

5、比如dotblot,比较于NC膜来说，它的优点是结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高—由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背景问题尤为突出（据分子克隆III说通过热处理的酪蛋白和1%聚乙烯毗咯烷酮延长封闭时间可以改善），而且当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质就容易从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，NC膜很容易封闭，也不需要特别

6、严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨I

7、nc膜尼龙膜灵敏度和分辨率低恢高结合能力80-110ug/cm2>400ug/cm2林料质地干的NC膜易脆秋而结实粋剂耐受性无无快作程序缓冲液祠湿，避免气泡缓冲液祠湿檢测方式當规染色，可用放射性和非放射性检则不能用阴离子染料适用范国0.45um—般蛋白0.2um—分子里小于20kD蛋白O.lum—分子里小于7kD蛋白低浓度小

8、分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸检则中）价格价格较便宜便宜4、杂交、预杂交的注意事项预杂交及杂交时保证buffer覆盖膜如果尼龙膜要多次探测，务必保证在任何时候都不要让尼龙膜干燥使用正确的杂交温度（使用DIGEasyHvb,DNA：DNA37—42°C,RNA：RNA68°C,RNA：DNA50°C)■为防止尼龙膜干燥，在准备好下一步处理用试剂之前不要倒掉正在用的溶液■使用合适的探针浓度■探针用之前变性■如果探针与靶DNA的同源性低于80%,热洗时应使用较低的温度（如60°C)■热洗之前应将

9、洗膜液预热到热洗所需温度5、如何判断提取的RNA的质量1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的,我们只看OD260/OD280（Ratio,R）,1.8-1.92）琼脂糖凝胶电泳：电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般的，如果28S和18S条带