生物技术药物发展.doc

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1、、生物技术药物发展前景：1)医药工业“十二五”发展规划生物技术药物已被列为五大核心发展目标之一。全球生物技术药物将进入大规模产业化阶段2)未来5年，全球药品销售保持3-6%增速，2015年达1.1万亿$，生物技术药物销售收入有望连续保持>15%增速，是全部药品销售收入增速的2倍以上3)预计2015年，中国生物医药市场有望达到1000亿美元4)在2010年世界前20位的畅销药物中，生物技术药物占到7种5)预计2020年，全球生物技术药物将占全部药品销售收入比重的1/3以上6)美、欧、日等发达国家市场

2、虽然仍居全球药品销售主导地位，但市场增速将放缓至1-4%7)中国、印度、巴西、俄罗斯等十余个新兴医药市场将以14-17%的速度增长。为生物技术药物和生产企业打开广阔市场空间2、利用基因工程技术生产药品的优点：1)可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障2)可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围3)利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质4)内源性生理活性物质在作为

3、药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。5)利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源3、逆（反）转录法：1)定义：以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成互补的单链DNA（cDNA），然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获取所需的基因。2)过程：以RNA为模板，由dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合成DNA分子。此过程RNA→DNA与核酸合成和转录DNA→RNA相反，故称为逆转录。3)优点：专一性强，cDNA与模板mRNA严格互补，不含内含

4、子，可合成自然界不存在的新基因。4)缺点：操作复杂，形成的mRNA为单链，生存时间短，不稳定，要求的技术条件较高。5)步骤:mRNA纯化→cDNA第一链合成→cDNA第二链合成→cDNA克隆→将重组体导入宿主细胞→cDNA文库的鉴定→目的cDNA克隆的分离与鉴定4、pBV220系统：1)组成:①来源于pUC8多克隆位点②核糖体rrnB基因终止信号③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子⑥pRC23的PL启动子及SD序列2)优

5、点：①可使表达产物不易降解②可表达非融合蛋白③利于质粒-宿主系统的稳定④可插入大片段外源基因⑤可增强启动作用3)适宜性：①本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要②本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%～30%5、乙酸控制1)控制措施：不同碳源、控制补料、稀释速率2)控制原理：控制菌体的糖酵解速度，使之低于TCA循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生3)控制代价：降低蛋白质合成和菌体生长4

6、)怎样控制发酵过程中的乙酸量以提高菌体的生长速率?①控制补糖速度②补氨③加酵母抽提物④加甲硫酸氨⑤改良菌株6、影响高密度发酵的因素1)培养基①基质中营养源的种类和含量比要求高②碳源和氮源比例偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶③比例偏大，则菌体繁殖数量少，细菌代谢不平衡，不利于产物积累④优化碳源、氮源以及微量元素和无机盐2)溶氧浓度①过高或过低都会影响细菌的代谢，对菌体生长和产物表达影响很大②维持较高浓度，不仅有利于菌体生长，而且有利于外源蛋白的表达③发酵过程中保持适宜度，必须确定发酵罐

7、的通气量和搅拌速度3)pH①稳定的pH是菌体保持最佳生长状态的必要条件②pH的改变会影响细胞的生长和基因产物的表达4)温度①影响细菌生长和调控细胞代谢②高温利于细菌生长，提高菌体的生物量③过高的温度会抑制菌体生长和外源蛋白质的表达5)代谢副产物①大肠杆菌在发酵的过程中，产生一些有害的代谢副产物:乙酸、二氧化碳等，抑制菌体的生长和蛋白的表达②降低代谢副产物积累措施：a.保持高溶氧的同时，采用流加补料的措施b.保持适当的比生长速率7、选择基因工程药物分离纯化方法的依据1)根据产物表达形式来选择p分泌型

8、表达产物的发酵液体积很大但浓度较低，纯化前必须浓缩，可用沉淀和超滤法。p可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。p产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化。p为了获得周质蛋白，经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。2)根据分离单元之间的衔接选择p应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。p先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分