口腔免疫研究方法.ppt

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1、免疫学研究方法免疫荧光技术酶联免疫吸附试验蛋白质印迹流式细胞术免疫学研究的主要方法一、免疫荧光免疫荧光概述免疫荧光基本原理免疫荧光基本操作免疫荧光技术的相关应用口腔应用实例1.概述免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。该技术的主要优缺点主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。2.基本原理直接免疫荧光法：直接法是将荧光素标记在抗体上，直接测定相应抗原。标记有荧光素的抗体与相应的抗原反应，在

2、紫外光的照射下，用显微镜观察荧光现象。优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点：只能检测一种抗原，灵敏度不高。间接免疫荧光法：间接法与间接ELISA相似，引入标记二抗，可以检测抗原，也可以检测抗体。优点：一抗可以结合多个标记二抗，固灵敏度比直接法高。缺点：比直接法易出现非特异荧光。免疫荧光原理示意图3.免疫荧光实验过程细胞爬片（多聚赖氨酸处理，生长密度70-80%）细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）细胞膜穿透（TritonX-100等）封闭（3%BSA-PBS等）一抗孵育荧光二抗孵育胞浆/核衬染（鬼笔环肽/DAPI/PI）封片荧光显微镜拍照荧光抗体孵育4.免疫

3、荧光技术的相关应用抗核抗体(均质型)抗核抗体(斑点型)抗核抗体(核膜型)①自身抗体检测第八节口腔免疫学研究的主要方法②病原体检测细菌（藤黄微球菌）寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）第八节口腔免疫学研究的主要方法③免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）第八节口腔免疫学研究的主要方法5.口腔应用举例天疱疮患者病损部位自身抗体的检测1.取天疱疮患者静脉血2ml，离心分离血清，-20℃保存。2.取正常皮肤做冰冻切片，加入FITC标记的抗人Ig-G、IgA、IgM、C3作间接免疫荧光染色，出现亮绿色荧光为阳性，以显示荧光的血清最大稀释度作为抗体的滴度。直接免疫荧光IgG上皮棘层呈翠绿色渔网状荧光细胞免

4、疫荧光技术组织免疫荧光技术直接法间接法小结二、酶联免疫吸附试验ELISA的原理和基本特点ELISA的类型ELISA基本操作步骤数据处理结果判断口腔应用举例1.ELISA的原理ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA），其免疫学原理:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。其特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值2.基本类型抗体测定法间接法检测特异性抗体抗原测定法直接竞

5、争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法间接法检测特异性抗体显色与待测抗体孵育与酶标抗体孵育加入底物包被已知抗原优点:只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法操作简单迅捷缺点：可重复性差通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断双抗体夹心法检测可溶性抗原双抗夹心法改良双抗夹心法优点：待测抗原需要≥2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相

6、载体和制备酶结合物就可以建立此法；重复性较好；缺点：操作复杂，费时费力3.ELISA基本操作步骤样品的保存试剂的准备固相载体包被加样孵育(温育）洗涤显色和比色注：每种ELISA试剂盒均有具体步骤说明4.ELISA数据处理根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程将所测定样品的OD值代入方程计算出相应的样品的浓度5.结果判断定性实验:显色反应后，如液体颜色变成蓝色则为阳性；仍为无色液体，则待测样品为阴性。定量实验1.标准品和待测样品的OD值减去空白孔的OD值2.绘制标准曲线，计算出待测样品浓度根据绘制的标准曲线以及待测样品的OD值可计算出待测样品浓度。6.口腔应用实例

7、龈沟液中细胞因子的检测龈沟液采集：去除待检牙牙面牙石，隔湿，吹干牙龈并擦干牙面，用2mm×10mmWhatman3M滤纸条两条，插入取样部位的牙周袋内，30s后取出(若血液和唾液污染，则弃置不用)，3min后在同一位点再次取样，将两条滤纸条作为一个标本置于同一Eppendorf（EP）管中，用龈沟液测量仪测量龈沟液量，在EP管中加入200μlPBS-T，置于-70℃的冰箱内保存。ELISA方法检测龈沟液中细胞因子（如IL-8/IL-4/TNF-α等）的浓度：将标本于冰箱内取出，室温解冻，4℃