用层析法分离、复性包涵体.doc

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1、用层析法分离、复性包涵体谷振宇 Jan-ChristerJanson 苏志国中国科学院过程工程研究所摘要    这里提出了一种用柱层析直接从Ecoli破碎原浆中分离纯化及复性包涵体的新方法。将传统的离心分离一步凝胶过滤所取代。分离的原则是选择合适的介质，使之仅排阻包涵体颗粒，而其它的组份都可以进入并穿过凝胶介质。在新的复性方法中，逐步递减的变性剂(urea或Gu-HCl)梯度与逐步递增的pH梯度相结合，通过凝胶过滤(排阻上限小于蛋白质分子量)层析来进行复性。溶解在高浓度变性剂及低pH中的变性样品，    然后加入到梯度形成好的层析柱中。在层析过

2、程中，变性蛋白质的下行速度大约是变性剂下行速度的3倍。因此，变性蛋白会经过已经形成好的变性剂和pH梯度，并逐步脱除变性剂，逐步地升高pH，这样可以促进正确的折叠。梯度的形状和程度，及流速都会影响复性率，而且可以针对不同蛋白质进行调节，以得到优化的条件。我们在此实验中选择的目标蛋白质为大肠杆菌表达的scFv融合蛋白包涵体。Rudolph和Lile的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍[1]。传统的分离、复性方法如：分步离心，稀释和透析通常很耗时且复性率低。本文中介绍了以凝胶过滤为基础发展起来的分离及复性方法。此方法的一个优势是变性剂的脱除，流速

3、及pH的变化可以很容易的调节。大肠杆菌表达的scFv融合蛋白质包涵体。ScFv片段在Eocli中表达量很高，但经常会形成包涵体。因此需要进行复性。材料与方法    脲(urea)、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸(arginine)、TritonX-100和DNAse购于Sigma。GSSG，GSH购于Roche。Berol185购于AkzoNobel表面化学公司，Sweden。所有层析介质均为AmershamPharmaciaBiotech公司产品。其它试剂均为分析纯。实验用水为Millipore纯水系统生产。所有层析实验

4、在AKTAExplorer层析工作站上进行。用于scFv57P活性检测的Biacore2000为Biacore(Sweden)公司生产。电泳设备采用AmershamPharmaciaBiotech公司的PhastSystem电泳设备。克隆与表达scFv57P    Fab57P的scFv抗体片段是通过VH-linker-VL的走向构建成pscFvHL57P[2]。载体选择用pscFew，它有一段可以使蛋白质表达到周质的pelB引导序列；一个15-aalinker,VH-SRGKSSGSGSESKST-VL，来连接抗体可变区的两个domain；C

5、-terminal的B10tag用于免疫识别[3]。在pscFvHL57P中VHdomain被设计成XhoI-XbaI位点，PCR扩增目标片段，VLdomain被设计成SacI-SpeI位点。PCR扩增目标片段。   ScFv57P抗体片段通过前人的方法表达在E.coli中[4]。通过Westernblot鉴定（用抗B10的抗体），发现表达的scFv57P形成对还原剂敏感的聚集体。经BIAcore鉴定细胞周质提取物原液，发现活性抗体片段的产量为5-10µg/l[5]。在pBAD/Thio-TOPO中克隆及过量表达scFv57P    以质粒ps

6、cFvHL57P为模版，将编码scFv57P的目的片段基因用PCR扩增。正相引物为(5’-acactgggatccatggcccaggcccaggtgaaactgctcgag-3’），其中包含了T7RNApolymerase的增强子和scFv57P中Vh的起始基因片段(下划线部分)。反相引物为5’-cacgatgcggccgctcgagtcgactaaacgttcgcgaccgccctgacg-3’用来保持原始pscFvHL57P构建的C端的B10tag(下划线部分）。扩增产物在N端多出4个氨基酸，在C端多出8个氨基酸(在B10tag之后)，这

7、是为了增加了几个不同的单一的酶切位点，简化后继的克隆表达。PCR过程如下：95℃(1min)-43℃(1min)-72(2min),30个循环。然后根据产品手册中的说明将扩增的目标基因直接嵌入pBAD/ThioTOPO（Invitrogencompany)质粒载体中，然后转化入TOP10E.coli宿主菌细胞内。在最终scFvHL57P在N端与thioredoxin(Trx)融合在一起(Fig.1B)并包括一个源于pscFvHL57P的B10tag，V5 tag，GKPIPNPLLGLDST和在C端的一个源于pBAD/Thio-TOPO的6*H

8、is的tag。阳性克隆通过检测过量表达产物的分子量来确定，对应的分子量应与构建的thioredoxin-VH-linker-VL-B10-V5-6Hi