用于家蚕转基因的二化性品种蚕卵的预处理研究.pdf

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1、第35卷第12期西南大学学报(自然科学版)2013年12月Vo1．35NO．12JournalofSouthwestUniversity(NaturalScienceEdition)Dec．2013文章编号：1673—9868(2013)12—0009—07用于家蚕转基因的二化性品种蚕卵的预处理研究①隆耀航，李姣蓉，赵天福，武婧洁，付巧娟，李冠楠，朱勇西南大学生物技术学院，重庆400716摘要：从二化性品种获得优质的非滞育蚕卵作为显微注射受体，一直是家蚕转基因技术中亟待解决的问题之一．目前家蚕转基因技术中非滞育蚕卵主要是通过完全低温

2、暗催青、早浸酸2种方法得到，但这2种方法分别存在催青时间长、浸酸时间难以把握的局限．对完全低温暗催青技术进行了改进，即在家蚕胚胎发育至温度敏感的缩短期(戊。期)后再对蚕卵低温黑暗处理直至孵化，结果表明：后期低暗组能有效地获得非滞育蚕卵并且较完全低暗组催青时间缩短3～4天．并进一步分析了后期低暗组、完全低暗组以及早浸酸组3种处理得到的非滞育卵的健康性，结果表明后期低暗组和完全低暗组健康性差异不大，均明显优于早浸酸组；后期低温暗催青在蚕卵孵化所需时间上具有明显的优势，且获得的非滞育卵健康性亦可得到保证，有望成为人们获得非滞育卵的一奈有效

3、途径．关键词：家蚕；滞育解除；显微注射中图分类号：$883文献标志码：A随着piggyBac转座子在家蚕转基因中运用的不断完善，近年来家蚕转基因研究取得了丰硕的成果]．与其他物种的转基因研究一样，选择合适的材料作为转基因实验的受体是转基因研究的一大重点．目前，家蚕转基因研究中首选的受体品种主要为多化性家蚕品种，如pnd—w1．多化性品种用作转基因受体虽然有着卵壳薄易于实验操作等优点，但是存在着经济性状差、不利于保种等不足，在转基因蚕的推广上多化性品种的劣势显得尤为突出．二化性家蚕品种经济性状优异，不存在保种困难的问题，且已经大量用于

4、蚕业生产，易于人们接受，如果使用二化性品种作为家蚕转基因的受体材料，在转基因蚕的推广上将极具优势．由于二化性品种具有一定的滞育期，如果使用二化性家蚕品种构建转基因系统将会遇到显微注射后蚕卵不能及时孵化的难题．家蚕蚕卵滞育(Diapause)是家蚕发育过程中的一个重要生理现象，通常是在产卵后胚胎发育到原肠胚阶段开始发动滞育_3]．二化性品种家蚕的滞育现象有着鲜明的特点：亲代蚕卵在25℃条件下催青后产下的子代蚕卵在产卵后会在24h左右进入滞育，如果亲代在胚胎时期处于低温黑暗环境中，会影响到蛹期滞育激素的分泌以及滞育激素受体的基因的表达[

5、4。而产下非滞育卵．在二化性家蚕的季节节律中，酯酶A4(EsteraseA4，EA4)是一种调控蚕卵滞育解除时间的重要物质[8]，它的活性受抑制因子PIN(Polypeptideinhibitoryneedle)的抑制[s．在二化性蚕卵进入滞育之前，盐酸的刺激可使结合于EA4上的PIN脱落而激活EA4的活性口，可有效地阻止蚕卵进人滞育．显微注射对蚕卵卵龄也有着苛刻的要求．蚕蛾交配后，精子随着蚕卵产下进入卵壳，25℃条件下大约①收稿日期：2O13—03—19基金项目：重庆市重大攻关项目(CSTC，2009AA1024)．作者简介：隆耀

6、航(1985一)，男，四川内江人，博士研究生，主要从事特种经济动物饲养的研究工作通信作者：朱勇，教授，博士生导师．l0西南大学学报(自然科学版)http：／／xbbjb．SWU．cn第35卷2h后精核与卵核开始融合，随后大约1h后受精卵开始核分裂，因此显微注射需尽量在产卵3h以内完成，如果超出该时问段将会严重影响转化效率．基于二化性家蚕的节律特点和转基因实验的操作需求，目前已有不少研究致力于将该品系用于家蚕转基【大]中，先后提出了低温暗催青和早浸酸等处理方法并都达到了预期的结果．目前亟待解决的问题在于优化已有的研究结果，以最简单有效

7、的预处理方法使二化性家蚕品系可高效的运用于家蚕转丛实验中．本实验运用统计学方法比较了低温暗催青和早浸酸方法的实用性，特别是对低温暗催青方法进行改进，试图在胚子发育关键的时期进行处理得到非滞育蚕卵，从而缩短低温暗催青的时间，以推动家蚕转基因研究．1材料与方法1．1蚕种与试剂家蚕品种：秋丰，皓月，734，N140，日5A，均为实用二化性品种，为本实验室保存．试剂：盐酸、甲醛均为国产分析纯．1．2蚕卵催青方法蚕种置于人工气候箱中，分别采用3种催青方式：出库第二天开始低温(18℃)全黑暗的完全低暗组，及前期25℃常规催青至缩短期(戊。)采用

8、低温暗催青的后期低暗组，并以常温常光照组为对照．孵化后的幼虫在正常温度和湿度下采用桑叶饲养，羽化后同一处理组内交配制种．每个品种同一种处理重复3次．1．3蚕卯早浸酸方法早浸酸实验为即时浸酸方法[1的改进，浸酸用盐酸比重1：100，液温