A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度.doc

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1、A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度原理：蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。优点：1.快速；2.对蛋白质无破坏性。缺点：1.不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。另外，当蛋白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜），另外核酸

2、可引起强烈干扰。灵敏度：0.2mg/ml~2mg/ml；比色杯最小测量体积为0.1ml。注意事项：1.实验室通常认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1.0时，蛋白浓度约为1mg/ml。2.如果实验所用的缓冲液和水有较高的光吸收值，说明缓冲液中有干扰物质存在。测量方法和计算公式：对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0，应将样品稀释至光吸收值小于2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280nm波长处的光吸收值，一般来说，1A280Unit≈1mg/ml(说明：此处默认蛋白的A280消光系数为1；对于浓度位于0

3、.02mg/ml~3mg/ml范围之内的蛋白样品而言如此，对于浓度小于0.1mg/ml的蛋白样品，可以采用以下的方法估算：蛋白浓度≈A205/31）；对于存在核酸污染（A280/A260<0.6）蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280nm和260nm波长处的光吸收值，或280nm和205nm波长处光吸收值，（0.5~1.0）按照以下公式计算：蛋白浓度（mg/ml）=[1.55×A280]－[0.76×A260]/蛋白浓度（mg/ml）=A205÷(27＋A280/A205)测量纯化出来的已知蛋白的浓度（或成分不明

4、的蛋白混合液）·步骤：1、到ProtParamtool网站在线预测该蛋白质的消光系数；2、用蛋白buffer作对照调零后，根据经验，将蛋白溶液稀释至合适的浓度，使其280nm处光吸收值位于0.5~1.0区间之内（通常试一次就能找到恰当的稀释比例）；3、做三次平行的测量，记录280nm光吸收值。（三次平行指独立稀释三次，测量三次）4、计算：A280/消光系数；【对于蛋白混合液，默认消光系数为1.0】三次平行的数据分别计算得到结果，然后求其平均值。·