紫外法测定血清总蛋白.ppt

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1、紫外分光光度法测定血清蛋白质临床生化实验室一、实验目的掌握紫外分光光度法测定血清蛋白质的原理。学习754型紫外分光光度计的使用方法。二、实验原理大多数蛋白质中酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一个紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋白质定量分析。二、实验原理由于生物样品中常混有核酸，核酸中的碱基对紫外也有吸收，但其峰值在260nm附近，因此可用下列公式计算蛋白质浓度：Lowry-Kalckar公式：蛋白

2、质浓度（g/L）=（1.45A280-0.74A260)×100（A280和A260分别代表光径为1cm时蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值。）三、实验操作（一）实验操作步骤1、取待测血清0.1ml于大号试管内2、取生理盐水9.9ml加入到此试管内，边放边震荡，轻轻混匀3、生理盐水调零，测定波长280nm及波长260nm的吸光度值三、实验操作（二）紫外分光光度计的使用方法1、接通电源，打开仪器开关，预热10min2、调波长为260nm3、依次把生理盐水、待测液倒入比色杯内，放入比色槽4

3、、推动拉杆至最前方，以生理盐水调零6、测定待测液的值7、调波长为280nm，重复3~6步的操作四、结果计算计算公式：蛋白质浓度（g/L）=（1.45A280-0.74A260)×100参考范围：正常人：60~80g/L五、方法学评价紫外法优缺点：优点操作简便，可保留蛋白生物活性；没有发生化学反应，标本可重复利用。五、方法学评价紫外法优缺点：缺点各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同，因此测定有一定误差；在280nm测定易受尿酸和胆红素的干扰，导致准确性和特异性受影响；若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大

4、的干扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公式校正测定，以消除核酸的影响，而推算出蛋白质浓度。临床意义见双缩脲法六、注意事项需用石英比色杯，光径=1cm，拿法同722型比色杯，价值昂贵，用时小心双用10ml的吸量管取生理盐水时，先查看吸量管刻度是否到尖端，若到尖端，应先放掉0.1ml，再将剩下的9.9ml液体放入试管中。六、注意事项由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干

5、扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法检测的准确性较差。