肿瘤干细胞分离及培养问题汇总.doc

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1、肿瘤干细胞分离及培养问题汇总进入肿瘤干细胞领域己经半年了，由于有很多瘤块资源所以有较多动手机会。以下为一些方法和心得。1，瘤块的消化因为实验比较紧迫，根据文献报道我们采用0.05%胶原酶I作为通用消化酶，不论组织来源，胃，肝，食管，前列腺等均相同。如果有足够的时间可以去细细的分类消化，应该会有意想不到的收获。瘤块用镶子尽量剪碎，过滤低速离心后用胶原酶重悬，消化时放入孵箱后每隔十分钟摇晃…次，二十分钟用吸管用力吹打同时显微镜下观察瘤块是否分散同时观测细胞活力。随着时间推移，瘤块越来越分散，而存活细胞逐渐增多。当瘤块致密形态缺失或者单个存在细胞特别多时终止消化，消化亦不要超过2小时，同时可以

2、采用分步消化法。过滤去除较大团块，低速离心去除杂质，可以多离几次。2,培养基的选择我们采用无血清培养基，加入bFGF及EGF3,培养板的选择我们采用普通细胞培养板，准备开始使用低粘附培养板，因为在干细胞培养过程中发觉有些细胞仍旧贴壁生长，而且有成纤维细胞。但是很大一部分仍旧为团块生长。所以具体实验可以分别对待。4,团块的传代我们采用Tryple作为消化酶消化团块，消化后40um滤过出去较大团块，之后低速离心计数，之后计算克隆形成率观察传代次数及干细胞纯化的能力。此为干细胞自我更新能力的检验。2,干细胞分化能力用含有血清的培养基培养不同时间点，最多做到十天，观察不同干细胞相关基因的表达水平

3、变化。同时可以用3D培养方法做克隆团免疫组化观察表皮，肌上皮等不同分化marker来定义克隆团的分化。3,TCA有些人认为在琼脂中可以克隆生长的均为干细胞。但是本身体系是加入血清的，所以乂有些人持怀疑态度。细胞系很多可以生长出较为漂亮的克隆。7,SP分选还是比较常规使用的干细胞分离方法，但己经有一部分文献已经报道此方法并不能应用于更多的组织来源细胞分离。8,动物实验金标准，如果可以找到一个细胞就可以成瘤，那么它肯定是干细胞,如果干细胞真的存在，已经有人报道了。我们现在做到了儿百个细胞成瘤在培养40天以后。做的是皮下注射。下一步准备做原位注射之后观测瘤块生长状态及其转移。9,在药物研发中的

4、作用这许多年癌症的治疗去的很大进步，但是要达到根治或者预防复发仍旧任重而道远。肿瘤干细胞的发现及其在药物治疗靶点的发现必定为肿瘤的治疗带来新的希望。祝福大家干细胞的分离纯化与体外培养简述。干细胞的分离与纯化干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c.kit等。另外各种成体干细胞还方各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为CD34+和Thylo而CD10,CD14,CD15,CD16,CD19,CD20皆为阴性［8］。这些特异的标记物可能与其分化调控有关，如上皮干细胞有整合素的高表达，而整合素可介导干细胞与细胞外基质粘附从而抑制其分化的发生。另外干细胞还有不

5、同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodaminel23染色。利用这些特性及表面标志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。干细胞的体外培养由于干细胞的数目很少，因此需要在体外对干细胞进行非分化性增殖。这需要许多生长因子和间质细胞的共培养oBrustle等人在体外成功地培养了鼠的ES细胞。他们首先把分离的ES细胞在含有FGF2的培养基中培养，随后加入上皮生长因子(EGF),最后在FGF2和PDGF的混合培养基中生长增殖。在这种培养条件下，ES细胞可以保持其分化潜能，如停止供给生长因子，ES细胞会分化为寡树突细胞或星状细胞［9］。不同组

6、织来源的干细胞的培养条件不尽相同。在应用前还需依据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。准确的分化诱导是应用干细胞治疗的基础。这需要对与干细胞发育有关的信号调节及微环境的影响进行详细研究。