细胞板与细胞培养.doc

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1、细胞培养板的选择和使用（四）点击次数：1574作者：clearairOO发表于：2008-07-2310:32转载清注明来自丁香园来源：丁香园（一）培养板的清洗和消毒培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。问：只有紫外照射可以保证无菌吗？可不可以从清洗方面做点工作？答：看你什么用途了，••般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，

2、再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后,打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯v20cm）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省厂，留点钱还不如买点好试剂呢：）我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖了在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯v30cm）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过：2、到放射科照CO60,照完了尽快用。我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重

3、复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板子，也不是很贵。我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干,用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可•以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在I日板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。紫外的穿透能力很弱，板K紫外照射时是否将盖K翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？板「泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干,然后放在工作台里（打开盖了）用紫外线照

4、射半小时以上，最好…小时或两小时，盖了同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会右细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗,紫外照射30-60分钟，不要时间太这样板了容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子！旧板子做，结果不准！泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸俺水清洗3-5次，然后泡在75%的酒精里（酒精用纯的无水乙甜），用前在紫外线下照射1

5、h。基本可保证95%以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。1.钻60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌.2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。（二）方法讨论细胞培养板常用来进行不同的处理效应观察，有些检测可能直接就在培养板中进行，这里面有些什么样的经验或小窍门呢？1.细胞培养与MTT问:做MTT时，96孔培养板细胞浓度该是多少？答:我觉得细胞的浓度并不需要那么精确，关键是接种于每孔的细胞数就大致处于同一水平。比如我做MTT,起初用的细胞浓度为5000/ml,符孔100ul,培养3天观

6、察，发现细胞数太少，各孔0D值反面难于比较。后来我换用10000/ml,结果就很好。当然细胞数也不能太多，这其实取决于你细胞的生长速度，生长快的细胞，可接种浓度低点。这主要是使细胞增殖率不致受处理因索之外的其他因素影响，比如接触抑制，营养竞争。总之，做MTT时细胞数应较低，目的就是为了排除其他因素的影响，以使每孔细胞生长情况尽可能地反映出处理因素的影响。细胞接种的浓度和你的实验目的、要求、细胞种类、处理因素的特殊要求都有关系。没有简单的，每孔接种多少的一个标准。当然，可以用楼上建议的浓度开始摸索。同时，注意肿瘤细胞核正常细胞的生长数度也不…样，前者生长快，后者慢，细胞数的量也有

7、讲究。到底多少合适，得根据你的实验具体要求来摸索。我做b16转染时，因为脂质体要求细胞融合度为30%-50%,曾经没孔接种过300-500个细胞，效果非常好，问:我做的MTT为什么同一组的两孔差别那么大呢？做了两次都是这样！答:产生差别的原因有多种1.在加细胞时,细胞沉淀下来,导致两孔细胞数不同。我们通常用磁力转子对细胞缓慢搅拌,时刻保持细胞处于悬浮状态。2.96孔板在培养箱中，山于湿度不够，而培养箱山于具有••定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快,导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状