细胞培养注意问题.doc

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1、细胞培养1、冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。2、细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO?除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)，在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。3、可否使用与原

2、先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5、何谓FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是

3、相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calfserum)则是指小牛血清°HS(horseserum)则是指马血清。6、培养细胞时应使用5%或10%CO2?或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。7、何时须更换培养基？视细胞

4、生长密度而定，或谩照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。8、培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？—般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Nae第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。10、悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基

5、于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg(约1,000rpm),5-1。分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。12、细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。13、细胞冷冻培养基之

6、成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO（dimethylsulfoxide）和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。14、DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissueculturegrade之DMSO（如SigmaD2650）,其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解

7、而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。15、冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于VC30〜60分钟一（-20°C30分钟*）-80°C16-18小时（或隔夜）液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3°C至-80°C以下，再放入液氮槽vaporphase长期储存。*-20°C不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入・8（TC冰箱中，惟存活率稍微降低一些。1

8、5、细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial,融合瘤细胞则以5x106cells/mlvial为宜。16、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减