ELISA技术方法原理.pdf

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1、酶联免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）ELISA的发展50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术1971年此项技术由瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道，将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附测定法（ELISA）ELISA基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保

2、留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关在ELISA方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）（3）酶反应的底物用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型双抗体夹心法测抗原（常用）夹心法双抗原夹心法测抗体（几乎不用）间接法测抗体（常用）竞争法测抗原竞争法竞争法测抗体捕获包被法测抗体亲和素-生物素ELISA法（放大信号作

3、用）包被特异性抗体双（已固定）抗体夹加入待测样品心孵育洗涤法测加酶标特异性抗体抗原孵育洗涤底物显色基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗酶联免疫吸附法体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。酶标仪450nm波长OD值根据校准品浓度对应的或双波长450/630nmOD值，使用双对数线拟合方式log（x）-log加终液50ul（Y）计算结果=concentration（浓度）37℃育温15分

4、钟×样品稀释倍数＝样品固相YY加底物液A和底物液B各50ul最终浓度抗洗板5次体-抗37℃育温（）分钟原-酶酶工作液50ul标抗血清样本体免疫高特异性高敏感性鼠人抗（）单克隆抗体作为包被抗体复合YY物YYYYYYYYYYYYCRP、ALB、BTAA•双抗夹心法适用范围待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG、CRP、ALB、BTAA等。不能用于分子量小于5000D的半抗原或小分子单价抗原的测定。双抗原夹心法测抗体（

5、不常用）反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗原。双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤。（2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。双抗原夹心法目前产品应用不多。测抗体应用间接法比较多

6、加终液固相Y抗加底物液显色原-抗体酶标抗原-酶标待测抗体抗原免疫复特异性固相抗原合物间接法测抗体☆间接法是检测抗体最常用的方法。☆原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。间接法测抗体本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。加底物液显色YYYYYY标记的抗体待测抗体特异性固相抗原竞争法测抗原◆如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合

7、。◆如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。◆参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与固相抗体的结合最充分。◆参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。•竞争法测抗体p当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。p标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳